大咖講堂 | 相干拉曼散射顯微術(shù)Ⅰ

“一花一世界”，這句充滿禪意的話在微觀視野中得到詮釋。而構(gòu)成世間萬千紛繁的原子由化學(xué)鍵聯(lián)合為分子，不同的分子往往具有特異性的化學(xué)鍵振動，成為它們的指紋特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）顯微術(shù)便是通過探測目標分子的特征振動來提供成像所需的襯度, 同時基于非線性光學(xué)過程大大增強拉曼散射的信號，提高成像速率以及檢測靈敏度的新型顯微技術(shù)^[1][2]。

▲水分子的三種振動模式示意

▲圖 1.水稻花粉的受激拉曼顯微成像圖（紅：脂質(zhì)；綠：淀粉；藍：蛋白）[3]

常見的光譜學(xué)手段按躍遷類型可分為兩大類：電子光譜和振動光譜。電子光譜涉及電子在不同能級間的躍遷（如吸收光譜和熒光光譜等）；振動光譜則作用于化學(xué)鍵或聲子的振動（如紅外吸收譜和拉曼散射譜）。如果把電子光譜比作靜如處子但威力強大的內(nèi)功；振動光譜則好似動如脫兔、招式鮮明的外家拳（見水分子振動示意圖）。紅外譜為直接共振吸收，信號很強但波長較長（中遠紅外），不利于含水環(huán)境的高分辨生物成像；我們通常講的拉曼散射指自發(fā)拉曼散射過程，信號非常弱（比熒光低 8-10 個數(shù)量級），無法用于快速成像。相干拉曼是增強拉曼的手段之一，利用短脈沖激光的非線性效應(yīng)實現(xiàn)增強，具有*的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

簡單概括，相干拉曼散射顯微術(shù)具有如下優(yōu)點：

1. 免標記和分子特異性：CRS 成像的信號來源于目標分子本身，無需外源標記物，也避開了藥物小分子等不易標記的問題，在活體（in vivo）觀測上更具有優(yōu)勢；可對具有不同拉曼譜的分子進行選擇性成像，比如生物樣品里常見的脂質(zhì)、蛋白、核酸和糖類等（如圖 1）；

2. 較高的探測靈敏度：相比于自發(fā)拉曼，成像速度一般有 3-5 個數(shù)量級的提升，一定條件下可實現(xiàn)視頻成像速度（每秒幾十幀）；

3. 光學(xué)層析和三維掃描：類似多光子顯微鏡的光學(xué)層析和三維成像功能；且由于所用的激發(fā)波長一般在近紅外，有較好的穿透深度和更小的光毒性。

根據(jù)非線性光學(xué)過程的不同，可將相干拉曼散射分為兩種：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。雖然這兩種非線性光學(xué)現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)（上世紀 60 年代），但長期僅作為光譜學(xué)測量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大學(xué)謝曉亮教授才分別將它們以實用顯微成像技術(shù)推廣開來^[4][5]。

▲圖 2. 自發(fā)拉曼散射、受激拉曼散射以及相干反斯托克斯拉曼散射的能級示意圖

自發(fā)與相干拉曼散射的能級示意圖見圖 2。自發(fā)拉曼只需要一束激發(fā)光，稱為泵浦光（ω_p），泵浦光子與分子發(fā)生非彈性碰撞，將部分能量轉(zhuǎn)移給分子振動。因此散射出來的光相對于泵浦光將發(fā)生一系列的頻率紅移，稱為斯托克斯光（ω_s），對應(yīng)到光譜儀中的一系列譜峰，成為該分子的指紋特征。泵浦和斯托克斯光子的頻率差正好共振于化學(xué)鍵的振動頻率（Ω=ω_p-ω_s），滿足能量守恒。對于相干拉曼散射，需將泵浦和斯托克斯這兩束激光同時作用于分子，當它們的頻率差（拍頻）共振于某個化學(xué)鍵的振動時，大量分子的同一個振動模式將被同步（相干地）激發(fā)起來，使得散射效率得到大大地增強。終表現(xiàn)為：泵浦光減弱（受激拉曼損失，SRL）、斯托克斯光增強（受激拉曼增益，SRG），并且出現(xiàn)反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新頻率分量（CARS）。自發(fā)拉曼散射與熒光、吸收等同屬線性光學(xué)范疇，一般使用連續(xù)激光即可。相干拉曼與雙光子熒光、二次諧波等都屬非線性光學(xué)范疇，需使用超短脈沖激光。常見的用于相干拉曼的光源是皮秒光參量振蕩器（OPO），輸出兩路皮秒光，一束波長固定（如 1064nm），另一束波長在近紅外區(qū)間可調(diào)，它們分別作為斯托克斯和泵浦光。調(diào)節(jié)激光波長使得我們可以改變待測拉曼頻率，選擇性地去探測不同的化學(xué)鍵/分子。

CARS 與 SRS 雖然都是三階非線性光學(xué)過程，它們之間有明顯的區(qū)別：CARS 是個四波混頻過程，產(chǎn)生的光子具有第三種頻率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合適的濾波片就可以簡單地提取出來；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之間的相互轉(zhuǎn)化過程，泵浦光子的湮滅和斯托克斯光子的產(chǎn)生同時發(fā)生，但沒有產(chǎn)生第三種光子；因此，通常用泵浦-探測技術(shù)中常見的調(diào)制解調(diào)的方式來提取信號，需要借助鎖相放大器來實現(xiàn)。CARS 顯微成像技術(shù)自 1999 年被發(fā)明以來，一直受困于非共振背景信號的干擾，典型的表現(xiàn)為光譜發(fā)生畸變（圖 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，謝教授課題組于 2008 年推出了 SRS 技術(shù)，地解決了上述問題。CARS 過程中能量被封鎖于電磁場/光子中，電子躍遷可繞過分子振動直接通過虛能級產(chǎn)生；而 SRS 的發(fā)生依賴于光子能量與分子振動之間的交換，具有嚴格的共振吸收特征。因此 SRS 在光譜上與自發(fā)拉曼一致（圖 3），在圖像上也不再受非共振背景的困擾（圖 4）。此外，SRS 的信號與分子濃度呈線性關(guān)系，更方便于定量解析復(fù)雜混合物體系中的各種化學(xué)成分。也因為這些特性，SRS 不斷獲得研究者們的青睞。

▲圖 3. 視黃醇在 1595cm^-1處的 Raman、CARS 與 SRS 的光譜對比 [5]

▲圖 4. CARS 與 SRS 對線蟲內(nèi)脂質(zhì)成像 [6]

綜上，CARS 與 SRS 都可以基于生物體中核酸、脂質(zhì)和蛋白等物質(zhì)自身的 Amide I、CH2、CH3 等化學(xué)鍵進行特異性成像。由于其免標記、高分辨率、快速成像以及三維掃描的優(yōu)點，CRS 在病理檢測、生物代謝、藥物運輸等方面具有廣泛應(yīng)用。具體的應(yīng)用部分將在下一課堂詳細講解。

下面讓我們先開啟幾個 CRS 的成像結(jié)果

▲圖 5. SRS 對 Hela 細胞中的核酸、蛋白和脂質(zhì)進行選擇性成像 [7]

▲圖 6. 小鼠腦腫瘤模型的受激拉曼成像。活體實驗中，在（a）肉眼無法分辨腫瘤的區(qū)域；（b）受激拉曼技術(shù)可以清晰的探測到腫瘤邊界；（c）離體鼠腦切片的 SRS 圖像。藍色代表蛋白豐富的腫瘤區(qū)域 [8]