集光：顯微鏡中數(shù)值孔徑的重要性

在試圖區(qū)分顯微鏡下觀察到的樣本細(xì)節(jié)時(shí)，數(shù)值孔徑（縮寫為‘NA’）是一個(gè)重要考慮因素。NA是一個(gè)沒有單位的數(shù)，與透鏡收集的光角度有關(guān)。在計(jì)算NA（見下文）時(shí)還考慮了介質(zhì)的折射率，通過將載玻片或細(xì)胞培養(yǎng)容器的折射率與浸沒介質(zhì)相匹配就可以分辨出樣本的更多細(xì)節(jié)。光從一種介質(zhì)傳播到另一種介質(zhì)時(shí)的行為方式也與NA有關(guān)（稱為“折射"）。本文還介紹了折射的簡(jiǎn)要?dú)v史，以及這一概念如何成為實(shí)現(xiàn)高NA的限制因素。

顯微鏡物鏡

如果您細(xì)看顯微鏡上的物鏡，您會(huì)看到鏡筒處銘刻有多種不同的信息和數(shù)字。除了放大倍數(shù)和光學(xué)校正外，您還將看到另一組沒有單位的數(shù)字。這就是物鏡上的數(shù)值孔徑（或‘NA’）（見圖1）。

物鏡的NA是相對(duì)重要并且與圖像分辨率相關(guān)。簡(jiǎn)單來說，分辨率是指物鏡區(qū)分樣本細(xì)節(jié)的能力。沒有對(duì)應(yīng)的高NA，高放大倍數(shù)的物鏡也無法對(duì)樣本的細(xì)節(jié)加以分辨。

簡(jiǎn)單來說，顯微鏡物鏡的NA就是透鏡在與所觀察物體的固定距離內(nèi)收集光的能力。光穿過樣本時(shí)，會(huì)以倒錐形進(jìn)入物鏡。但樣本中的部分光會(huì)出現(xiàn)折射（和反射），這樣反過來形成的圖像會(huì)具有較高的分辨率，并且比具有較低NA的物鏡包含更多的細(xì)節(jié)信息。

孔徑角

圖1：NA位于放大倍數(shù)后面（這里是：40x/0.6）

孔徑角

物鏡前透鏡收集到的光錐角的最大徑向角度又稱為‘孔徑角’（見圖1）。除了增加NA外，圖像亮度也與孔徑角成正比。孔徑角隨物鏡焦距而變化，它與物鏡前透鏡在樣本聚焦時(shí)捕獲的從樣本發(fā)出的成像光線的最大角度有關(guān)。

孔徑角與物鏡焦距成反比。隨著焦距的減小，物鏡前透鏡所能收集的光量也會(huì)增加。換言之，如果物鏡距離樣本很近，那么物鏡可以收集到更多的斜射光線。應(yīng)該說，孔徑角通常由物鏡內(nèi)的光學(xué)元件決定，每個(gè)物鏡都有一個(gè)最佳焦距。打個(gè)比方，想象一下：如果您站在一扇門前，門上有一個(gè)鑰匙孔可以看到另一個(gè)房間，那么當(dāng)您在遠(yuǎn)處時(shí)只能看到房間里的一點(diǎn)點(diǎn)光和極少的物品。如果您把眼睛湊近鑰匙孔，您將會(huì)看到房間里更多的細(xì)節(jié)和光線，因?yàn)槔碚撋夏黾恿搜劬Φ目讖浇恰?/span>

通過物鏡來收集并形成的圖像亮度和圖像細(xì)節(jié)（分辨率）與孔徑角有關(guān)。來自樣本的光會(huì)連續(xù)通過蓋玻片與物鏡前透鏡之間的空氣或者穿過浸沒介質(zhì)。

圖2：孔徑角（A）是由前透鏡收集的

光錐的最大縱向角。α是光錐角的一半

NA的計(jì)算

數(shù)值孔徑可以用下列公式來表達(dá)和確定：
在以上公式中，‘n’為蓋玻片和物鏡前透鏡之間的介質(zhì)折射率（例如空氣、水或油）?！痢?hào)與光錐角的半角有關(guān)并且可通過透鏡進(jìn)行收集（即孔徑角；見圖2）。

圖3：物鏡的焦距越短則孔徑角越寬，

從而獲得更高的NA和分辨率

空氣的折射率約為1.0，而水的折射率為1.3，用于光學(xué)顯微鏡的一些浸油的折射率可以高達(dá)1.52。

折射

要*理解NA，先理解折射會(huì)比較有幫助。在光學(xué)和顯微鏡學(xué)當(dāng)中，折射是指光波穿過樣本以及從樣本中傳來時(shí)改變了方向，這是由于光傳播經(jīng)過的介質(zhì)（例如空氣、玻璃、水或油）發(fā)生了改變。‘斯涅耳定律’中的公式就很好地對(duì)折射進(jìn)行了描述。Willebrord Snellius（1580-1626）是荷蘭數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家。他確定出計(jì)算地球半徑的新方法，還通過數(shù)學(xué)方法對(duì)折射進(jìn)行了描述并因此名聲大噪。但他并不是第一個(gè)用數(shù)學(xué)方式描述折射現(xiàn)象的人，更準(zhǔn)確地說，他只是“重新發(fā)現(xiàn)"了波斯數(shù)學(xué)物理學(xué)家Ibn Sahl 對(duì)于這種現(xiàn)象的描述。Ibn Sahl在984年的手稿中，就闡述了曲面透鏡和鏡子如何彎曲并聚焦光線。

斯涅耳定律中指出，入射光和折射光的角度之比等于光通過的折射率之比的倒數(shù)。

簡(jiǎn)單地說，當(dāng)光線從一種介質(zhì)傳播到另一種介質(zhì)時(shí)，它的速度會(huì)發(fā)生改變 – 例如當(dāng)光從空氣傳播到水中時(shí)，光的速度會(huì)減慢。此外，當(dāng)光以非90°的角度進(jìn)入介質(zhì)時(shí)，其速度的變化會(huì)導(dǎo)致方向改變。需要注意的是，光的頻率不會(huì)改變，但是波長(zhǎng)將由介質(zhì)的性質(zhì)決定。

理論上，物鏡前透鏡收集的光錐的最大孔徑角為180°，α值為90°。由于90度的正弦值為1，因此能夠在空氣介質(zhì)中從樣本上收集180°合成光的物鏡的理論NA值也為1。顯然，折射率是實(shí)現(xiàn)物鏡最高NA的限制因素。因此，高NA物鏡都會(huì)用浸泡介質(zhì)代替空氣，如油或水?，F(xiàn)實(shí)中，在樣本和物鏡前透鏡之間有空氣的情況下NA值不可能達(dá)到1，因此“干透鏡"（即非浸沒物鏡）的最高NA值接近0.95。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)透鏡無法從樣本中收集180°的光，而最寬的角度約為144°。144°的正弦值為0.95而空氣的折射率為1.0，因此理論上最大值NA接近0.95。

高倍放大物鏡搭配較低的NA最終只能獲得較低的分辨率。很多顯微鏡企業(yè)在其物鏡當(dāng)中盡可能將NA提高。所以如果您正在考慮為顯微鏡購買新的透鏡，那就要隨時(shí)考慮如何在自己的預(yù)算范圍內(nèi)購買到NA最高的物鏡了。

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