多色顯微成像：多色標(biāo)記的重要性

在成像過(guò)程中避免熒光串?dāng)_的誤導(dǎo)效應(yīng)

多通道一詞是指使用多種熒光染料來(lái)檢查一個(gè)樣本中的不同元素。多通道成像可以同時(shí)觀察相關(guān)組分和過(guò)程，從而為您的觀察添加更多背景信息，最終提供更有意義的結(jié)果。 這種多色實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子是活細(xì)胞/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，該試驗(yàn)已使用兩種顏色，但可與額外的標(biāo)志物相結(jié)合，產(chǎn)生 更高的信息密度。 它還有助于觀察采用其他方法可能會(huì)遺漏的相互依賴性。
圖像： 成年大鼠腦。神經(jīng)元（Alexa Fluor488，綠色）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）、細(xì)胞核（DAPI，藍(lán)色）。圖像由中國(guó)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所和神經(jīng)內(nèi)科徐恩教授提供。

簡(jiǎn)介

多色或多通道顯微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物過(guò)程。例如在免疫腫瘤學(xué)中，有必要研究不同免疫細(xì)胞相對(duì)于關(guān)鍵生物標(biāo)記物的位置。在神經(jīng)科學(xué)中，了解神經(jīng)元突觸的復(fù)雜性通常需要研究多種蛋白質(zhì)。在研究連通性時(shí)，必須清楚識(shí)別不同類型的神經(jīng)元及其位置。
多通道成像需要使用多個(gè)熒光團(tuán)來(lái)對(duì)感興趣的不同標(biāo)記物染色。為實(shí)驗(yàn)選擇合適的熒光團(tuán)組合至關(guān)重要。每個(gè)熒光團(tuán)都有一個(gè)特征發(fā)射光譜，即其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍。大多數(shù)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜很寬，因此當(dāng)使用兩個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)時(shí)，它們可能會(huì)重疊，導(dǎo)致信號(hào)串?dāng)_。如果在實(shí)驗(yàn)中不考慮串?dāng)_，數(shù)據(jù)可能會(huì)導(dǎo)致假陰或假陽(yáng)的結(jié)果，或其他形式的模糊數(shù)據(jù)。因此，區(qū)分熒光團(tuán)對(duì)于在多通道成像時(shí)獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。本文詳細(xì)討論了在設(shè)置多色熒光實(shí)驗(yàn)以及避免重大缺陷方面需要考慮的一些事項(xiàng)。

選擇合適的熒光團(tuán)組合

選擇合適的熒光團(tuán)來(lái)標(biāo)記樣本時(shí)需要仔細(xì)考慮，如果要避免串?dāng)_，應(yīng)確保熒光團(tuán)與活細(xì)胞相容，并消除生理學(xué)方面的副作用。
閱讀本文，進(jìn)一步了解熒光團(tuán)與活細(xì)胞的相容性和生理學(xué)副作用
盡管市場(chǎng)上提供的熒光染料數(shù)量顯著增加，但信號(hào)分離問(wèn)題仍然存在。因此，對(duì)標(biāo)記策略的選擇仍然非常復(fù)雜，而且隨著添加的熒光團(tuán)越來(lái)越多，實(shí)驗(yàn)的設(shè)置也變得更加復(fù)雜。
為了避免串?dāng)_，光譜分離需要考慮以下因素：

• 熒光團(tuán)激發(fā)和發(fā)射光譜必須與系統(tǒng)的光源和濾光片組特性相匹配，并且

• 每個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜在探測(cè)窗口之間的重疊必須盡可能少。
  如何捕捉多個(gè)熒光信號(hào)？

• 例如，考慮一種常見寬視場(chǎng)（常被含糊地稱為“熒光顯微成像"）多色實(shí)驗(yàn)的情況。通常會(huì)使用寬視場(chǎng)熒光顯微鏡，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便且圖像采集快。寬視場(chǎng)多色實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)標(biāo)記都使用專用的激發(fā)和發(fā)射濾光片組進(jìn)行識(shí)別，這可以確保在從每個(gè)熒光團(tuán)獲得單個(gè)信號(hào)時(shí)具有高度的特異性。激發(fā)和發(fā)射濾光片通常放置在顯微鏡內(nèi)單獨(dú)的濾光片輪中。這種設(shè)置已經(jīng)限制了可以為實(shí)驗(yàn)選擇的熒光團(tuán)。樣本中的熒光團(tuán)可能與顯微鏡中已經(jīng)安裝的濾光片不相容。當(dāng)然，濾光片組濾色塊可以更換為其他市售濾色塊，但這個(gè)過(guò)程通常很繁瑣。
  選擇與可用濾光片和光源相容的熒光團(tuán)并將樣本染色后，下一步就是設(shè)置系統(tǒng)。首先必須選擇濾光片，然后進(jìn)行平衡，以達(dá)到一定程度的信號(hào)探測(cè)和最小程度的串?dāng)_。接下來(lái)要對(duì)濾光片進(jìn)行調(diào)整來(lái)限制波長(zhǎng)帶通，并使發(fā)射光以各個(gè)熒光團(tuán)的峰值波長(zhǎng)為中心。這個(gè)步驟能夠減少探測(cè)到來(lái)自其他熒光團(tuán)的無(wú)用發(fā)射光。
  濾光片通過(guò)以下方法“凈化"單個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)：

• 最大限度減少激發(fā)無(wú)用的熒光團(tuán)，也就是那些與所使用的特定濾光片不相容的熒光團(tuán)；以及

• 消除與所需熒光團(tuán)的峰值發(fā)射波長(zhǎng)不匹配的信號(hào)干擾（光輸入）。

所選的探測(cè)窗口帶寬決定了將探測(cè)到多少無(wú)用的信號(hào)以及會(huì)丟棄多少有用的光信號(hào)——窄帶寬意味著特異性較高，但效率較低；而寬帶寬則意味著特異性較低，但效率較高。使用的熒光團(tuán)數(shù)量越多，這個(gè)平衡過(guò)程就越復(fù)雜。理想情況下，每個(gè)熒光團(tuán)組合都需要一組優(yōu)化的濾光片，以便從每個(gè)熒光團(tuán)捕獲最大的發(fā)射強(qiáng)度，同時(shí)使探測(cè)通道之間的串?dāng)_最小化。即使使用此方法，一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射光仍然會(huì)滲入用于另一個(gè)熒光團(tuán)的探測(cè)通道。因此，通過(guò)調(diào)整濾光片來(lái)減少串?dāng)_會(huì)犧牲有用信號(hào)，這可能導(dǎo)致關(guān)鍵數(shù)據(jù)丟失。所有這些因素都使獲得良好熒光圖像變得復(fù)雜。
另一個(gè)考慮因素是這種激發(fā)/發(fā)射機(jī)制的性質(zhì)，它意味著每個(gè)單獨(dú)的熒光團(tuán)必須依次成像，即依次使用一個(gè)又一個(gè)濾光片，這意味著需要更多時(shí)間來(lái)更換濾光片和采集圖像。這個(gè)過(guò)程必須為每個(gè)位置、焦平面和時(shí)間點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行，這意味著每增加一個(gè)熒光團(tuán)，采集完整的樣本圖像就需要更多的時(shí)間。在活體樣本的實(shí)驗(yàn)中，從一個(gè)熒光團(tuán)切換到另一個(gè)熒光團(tuán)所需的時(shí)間會(huì)限制捕獲速度，導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)快速的過(guò)程以及降低各種顏色之間的可比性。
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在多通道實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免串?dāng)_的其他方法

可以使用其他消除串?dāng)_的方法，例如在采集后進(jìn)行線性光譜拆分。 這種方法的前提條件是光譜成像，即探測(cè)分別包含不同發(fā)射信息的多張圖像[1]。光譜成像可以在寬視場(chǎng)或共聚焦顯微鏡上以多種方式進(jìn)行。在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡中，此操作通常需要專用的濾光片，并且仍然需要連續(xù)采集，這非常耗時(shí)，而且由于重復(fù)激發(fā)，容易發(fā)生光漂白。
線性光譜拆分法可以確定每個(gè)熒光團(tuán)對(duì)每個(gè)圖像像素的相對(duì)貢獻(xiàn)，方法是以計(jì)算方式拆分所測(cè)量信號(hào)的熒光元素，并將其與參考發(fā)射光譜輪廓匹配。使用線性光譜拆分法需要事先了解熒光團(tuán)發(fā)射光譜，并且通常需要制定復(fù)雜的手動(dòng)后期處理計(jì)劃。此外，對(duì)有噪圖像使用這種方法可能容易出錯(cuò)。要避免處理后的圖像中出現(xiàn)偽影，必須通過(guò)背景消減法去除并非來(lái)自熒光團(tuán)的任何信號(hào)。此外，由于線性光譜拆分是一種基于像素的方法，因此它容易受到原始圖像或參考光譜中所引入誤差的影響。因此，噪聲的存在使得光譜拆分后數(shù)據(jù)的任何潛在誤差與熒光團(tuán)的光譜重疊成比例增加。這種效應(yīng)會(huì)影響低光照強(qiáng)度下拍攝的圖像，例如在對(duì)活體樣本成像時(shí)。
是否有更好的方法？

成像領(lǐng)域的最新創(chuàng)新包括將相量分析應(yīng)用于光譜數(shù)據(jù)[2]。Cutrale 等人[3]開發(fā)了一種有效的方法，即使在低噪聲機(jī)制中也能拆分多個(gè)熒光團(tuán)，而無(wú)需了解發(fā)射特性和顯微鏡的透射特性。該方法既快速又可靠，而且基本上能夠分離自發(fā)熒光等背景信號(hào)和真正的單個(gè)信號(hào)。
基于相量的分析法最初被認(rèn)為是一種將熒光壽命信息可視化的有效方法，最近 Cutrale 等人調(diào)整了這個(gè)方法，能夠在不使用參考光譜的情況下實(shí)時(shí)分離光譜信息。結(jié)果是，不僅分離了來(lái)自光譜圖像采集的熒光信號(hào)，而且可以去除無(wú)用的信號(hào)，如自發(fā)熒光，從而改善實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果。此外，光譜成像數(shù)據(jù)分析的整個(gè)工作流程得到簡(jiǎn)化，因此它不需要像其他方法（如線性光譜拆分）那樣進(jìn)行廣泛的校準(zhǔn)。
通過(guò)光譜相量分析可以快速可靠地拆分熒光顯微成像的光譜圖像

光譜成像中運(yùn)用的相量分析是一種已公開發(fā)表的方法，可用于簡(jiǎn)化多通道成像實(shí)驗(yàn)并提高其準(zhǔn)確性。

圖 1：MDCK細(xì)胞 DNA 用Hoechst（藍(lán)色）染色，線粒體用Alexa 488（綠色）染色，微管用Alexa 555（紅色）染色，樣本由馬爾堡大學(xué) Ralf Jacob 教授提供。

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