DMi8與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究

DMi8與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究
——如何為您的研究選擇和配置顯微鏡
 
新冠也許是人類已知的作為危險(xiǎn)的病毒之一，其傳播力強(qiáng)、途徑隱秘危害性大，而面臨如此大敵，多虧了核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展才可以使其無(wú)所遁形。但是核酸檢測(cè)技術(shù)首先都需要對(duì)核酸中的信號(hào)進(jìn)行放大，以新版的國(guó)家新冠指南中所描述，需要將收集到的DNA進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)展后才可以用于檢測(cè)，這個(gè)參數(shù)雖然較之之前的40個(gè)循環(huán)有所減少，但是放大倍數(shù)也有2³⁵之多，可以想象如果中間有任何錯(cuò)誤都會(huì)被放大如此高的倍數(shù)。怎么樣才能測(cè)得準(zhǔn)確呢？標(biāo)準(zhǔn)品是關(guān)鍵的保證之一。
面對(duì)新冠的核酸檢測(cè)方案中的標(biāo)準(zhǔn)品，上海交通大學(xué)的樊春海院士在此方面做出了最關(guān)鍵的貢獻(xiàn)。2020年初在他主持下的國(guó)家轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科學(xué)中心積極支持下，上海市計(jì)量院與交大的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)夜以繼日攻關(guān)，僅用42天及時(shí)研發(fā)出新冠核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)——GBW（E）091111和GBW（E）091112，并經(jīng)國(guó)家緊急授權(quán)于2020年3月19日獲批，為核酸試劑盒提供計(jì)量溯源和質(zhì)量控制依據(jù)，供百余家研制單位使用，為疫情防控做出重要貢獻(xiàn)和基礎(chǔ)保障。擁有170年光學(xué)技術(shù)沉淀的徠卡顯微系統(tǒng)也非常有幸能為樊院士的研究提供力所能及的支持。
 
圖片轉(zhuǎn)載自“上?？萍?rdquo;公眾號(hào)，作者：一諾
工欲善其事必先利其器，在成就偉大的科研成果之前，對(duì)設(shè)備的配置選擇是首要因素之一。光學(xué)顯微鏡通常是生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的主要設(shè)備之一。它可在多種應(yīng)用中幫助解開(kāi)科學(xué)謎團(tuán)。因此，從明場(chǎng)顯微鏡到熒光顯微鏡和活細(xì)胞成像，顯微鏡的配置和功能對(duì)于其應(yīng)用范圍至關(guān)重要。
 
 
 
您研究什么樣本？
選擇研究顯微鏡時(shí)，首要的考慮因素是研究的樣本類型。如果是放置在薄載玻片上的固定樣本，您可以選用正置顯微鏡?；罴?xì)胞檢測(cè)則需要使用顯微鏡的特殊功能，因?yàn)樗鼈兪欠旁诔錆M細(xì)胞培養(yǎng)液的大細(xì)胞培養(yǎng)容器中。
 
 
圖1：左：放置固定樣本的載玻片，例如組織切片。右圖：用于細(xì)胞培養(yǎng)的有蓋培養(yǎng)皿。
只有物鏡在樣本下方而聚光鏡在樣本上方的倒置配置，才能提供基本的自由空間和物鏡與樣本之間的接近度。與此同時(shí)，倒置顯微鏡還可以很好地接近細(xì)胞，例如添加顯微操縱器。
此外，活細(xì)胞需要適當(dāng)?shù)沫h(huán)境才能生存。溫度和二氧化碳濃度必須保持在一定水平。完成這項(xiàng)任務(wù)需要一個(gè)帶有相應(yīng)控制器的氣候室。
 

 
圖2：左：正置顯微鏡的特點(diǎn)是物鏡在樣本上方，聚光鏡在樣本下方。右：倒置顯微鏡的設(shè)置恰好相反，主要是為了向用戶提供更多空間以及物鏡與樣本之間所需的接近度。
 
您認(rèn)為是在哪些維度？
顯微樣本展開(kāi)成三個(gè)維度：長(zhǎng)度、寬度和高度。一些樣本，例如組織切片，僅在xy方向上成像，而其他應(yīng)用可能也需要在z方向上進(jìn)行采集。成像3D體積，例如，對(duì)于活細(xì)胞，建議使用電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)，它能夠逐步引導(dǎo)您的樣本通過(guò)焦點(diǎn)。成像軟件應(yīng)該能夠重建單個(gè)圖像以進(jìn)行3D可視化。
對(duì)于活細(xì)胞，您必須添加時(shí)間維度。在這種情況下，系統(tǒng)穩(wěn)定性便是另一個(gè)關(guān)鍵特性。由于在采集過(guò)程中溫度變化會(huì)影響成像系統(tǒng)，因此必須采取有效的應(yīng)對(duì)措施。自適應(yīng)對(duì)焦控制（AFC）等自動(dòng)對(duì)焦調(diào)整可消除這些熱影響，并始終找到預(yù)定義的焦點(diǎn)。
 

圖3：自適應(yīng)對(duì)焦控制（AFC）也可以在長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)采集期間自動(dòng)穩(wěn)定顯微鏡焦點(diǎn)。傳感器檢測(cè)到LED光束（850 nm）的運(yùn)動(dòng)，如果載有樣本的蓋玻片改變其位置，例如由于熱活動(dòng)，就會(huì)發(fā)生這種運(yùn)動(dòng)。
 
哪種對(duì)比方法適合您的樣本？
用顯微鏡研究的大多數(shù)細(xì)胞——尤其是動(dòng)物細(xì)胞——沒(méi)有足夠的內(nèi)在對(duì)比度來(lái)讓研究人員觀察細(xì)節(jié)。研究人員使用對(duì)比方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。相襯（PH）和微分干涉對(duì)比（DIC）可操縱穿過(guò)樣本的光以增加對(duì)比度，您也可以分別使用熒光蛋白通過(guò)熒光染料（免疫熒光）對(duì)其進(jìn)行染色。
根據(jù)對(duì)比方法，顯微鏡需要特定的設(shè)備；例如相襯需要特殊的物鏡，而DIC使用某些必須切換到光路中的棱鏡。對(duì)于熒光顯微鏡，您需要特殊的熒光濾色塊，以促使正確的光波長(zhǎng)進(jìn)入和退出樣本。
 
 
圖4：用不同對(duì)比方法獲得的一系列神經(jīng)元細(xì)胞。從左到右：明場(chǎng)、DIC、相襯、熒光
 
光源呢？
對(duì)比方法的選擇也決定了光源。用于傳統(tǒng)明場(chǎng)顯微鏡、相襯和DIC的透射光照明可以使用鹵素或LED照明進(jìn)行。熒光顯微鏡可以通過(guò)LED照明或在汞燈、氙燈或汞金屬鹵化物燈的幫助下進(jìn)行。
 
您想記錄或發(fā)布您的結(jié)果嗎？
如果您想拍攝樣本圖像或進(jìn)行活細(xì)胞成像，則需要一個(gè)數(shù)碼顯微鏡攝像頭。特別是在熒光活細(xì)胞成像的情況下，建議使用靈敏的攝像頭，以盡量減少可能傷害細(xì)胞的激發(fā)光量。除了成熟的CCD和EMDDC攝像頭外，如今的sCMOS攝像頭也因其高量子效率和采集速度而得到應(yīng)用。有關(guān)數(shù)碼顯微鏡攝像頭的更多信息，請(qǐng)閱讀文章“數(shù)碼攝像頭技術(shù)簡(jiǎn)介”。
此外，大視野（FOV）有助于更快地找到感興趣的區(qū)域并同時(shí)成像更多細(xì)胞?，F(xiàn)代研究顯微鏡的攝像頭端口具有19毫米FOV，與19毫米sCMOS攝像頭芯片匹配。
通常，僅拍攝樣本圖像是不夠的，還需要分析您獲得的數(shù)據(jù)。為此，易于使用的成像和分析軟件有助于獲取定量數(shù)據(jù)并進(jìn)行可靠的數(shù)據(jù)分析。
 
您是否需要采集厚樣本的（3D）信息？
厚樣本對(duì)顯微鏡檢查來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn)。尤其是寬場(chǎng)顯微鏡在同時(shí)照亮整個(gè)樣本的情況下，來(lái)自焦點(diǎn)外區(qū)域的額外光會(huì)顯著減少焦點(diǎn)內(nèi)的樣本特征。
成像解析可以幫助獲得沒(méi)有失焦光的圖像。該技術(shù)可以應(yīng)用于單個(gè)圖像平面以獲得即時(shí)結(jié)果（ICC：即時(shí)成像解析），或者可以與額外的反卷積步驟（SVCC：小容量成像解析；LVCC：大容量成像解析）以獲得更好的結(jié)果。反卷積將光子信息重新分配給它們的起源，從而在焦平面中提供更好的所需結(jié)構(gòu)對(duì)比度。與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)圖像相比，這可以讓用戶更容易地將感興趣的結(jié)構(gòu)與背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。
 

圖5：癌組織中的單分子RNA-FISH。RNA-01（綠色）、RNA-02（品紅色）左：原始數(shù)據(jù)。中：使用即時(shí)成像解析。右圖：大容量成像解析之后。由蘇黎世大學(xué)（瑞士）的Andreas Moor教授提供。
 
您想在顯微鏡上操作細(xì)胞嗎？
在過(guò)去的幾年里，樣本的圖像處理變得日益普遍。這意味著研究人員不僅要觀察活細(xì)胞，還要借助光來(lái)操縱它們。光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP）是有助于了解動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程的一個(gè)示例。對(duì)于這些類型的操作技術(shù)，通常需要額外的光源，這些光源必須集成到顯微鏡的光路中。
這種方法并非易事。徠卡無(wú)限端口是一種通用解決方案，可將附加光源耦合到顯微鏡的光路中，而不會(huì)影響圖像質(zhì)量，例如：FRAP、光開(kāi)關(guān)、消融或光遺傳學(xué)。有了合適的適配器，研究人員甚至可以連接他們的自制設(shè)備。
 
 
圖6：徠卡WFFRAP模塊（左側(cè)黑框）可通過(guò)無(wú)限端口與倒置研究顯微鏡徠卡DMi8連接。
 
您的預(yù)算是多少？
一個(gè)重要的問(wèn)題是您可以投入的資金。一些顯微鏡供應(yīng)商提供適合特殊應(yīng)用的預(yù)定義配置。但是，如果您不需要所有付費(fèi)的預(yù)配置組件怎么辦？這就是為什么免費(fèi)配置組件比購(gòu)買(mǎi)預(yù)定義的顯微鏡系統(tǒng)更經(jīng)濟(jì)的原因。
此外，對(duì)顯微鏡的要求可能會(huì)隨著時(shí)間而改變。在這種情況下，可升級(jí)系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)預(yù)定義和固定的配置，您會(huì)發(fā)現(xiàn)僅需有限數(shù)量的應(yīng)用程序。可升級(jí)性讓您可以根據(jù)不斷變化的需求靈活配置。
考慮到這些因素，徠卡DMi8等模塊化顯微鏡平臺(tái)可以使研究人員從經(jīng)濟(jì)的顯微鏡系統(tǒng)入門(mén)，然后隨著需求的增長(zhǎng)而不斷升級(jí)。
 
 
圖7：利用模塊化設(shè)計(jì)，徠卡DMi8可以根據(jù)研究人員的需要進(jìn)行配置。此外，如果需求發(fā)生變化，后期還可以進(jìn)行升級(jí)。
 
誰(shuí)使用顯微鏡？
顯微鏡用戶的范圍可能差異很大。尤其是在大學(xué)，用戶可能非常有經(jīng)驗(yàn)，也可能是絕對(duì)的初學(xué)者。因此，由徠卡應(yīng)用套件X(LAS X)等直觀軟件運(yùn)行的易于使用的顯微鏡系統(tǒng)有助于人們快速入門(mén)并快速獲取數(shù)據(jù)。例如，面向工作流的設(shè)計(jì)、圖像分析向?qū)б约皩⑼鈬O(shè)備無(wú)縫集成到系統(tǒng)中可以簡(jiǎn)化您的工作。
除了寬場(chǎng)研究顯微鏡外，體視顯微鏡也經(jīng)常用于生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室。您可以在“選擇體視顯微鏡時(shí)要考慮的因素”一文中了解更多信息。
 

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