學(xué)習(xí)如何從共聚焦圖像中去除自發(fā)熒光

自發(fā)熒光有許多潛在的原因，在一個樣品中往往有多個來源。首先，細(xì)胞制劑本身可以是內(nèi)源性自發(fā)熒光的來源。一些常見的來源是NADH、黃素、脂褐素、膠原蛋白和彈性蛋白，以及植物樣品中的葉綠素和木質(zhì)素。換句話說，它們是很難消除的。

除了細(xì)胞增加了自發(fā)熒光外，在成像前處理樣品的方式也會引入額外的背景熒光。從處理試劑到封片介質(zhì)，這可能是任何東西。在去除自發(fā)熒光之前，找到自發(fā)熒光的來源是很重要的。

如果您遇到自發(fā)熒光的問題，首先要做的是通過調(diào)查樣品來嘗試確定原因。當(dāng)您開始實驗時，先選擇一個未標(biāo)記的對照品，以確定染色過程中是否有增加背景熒光。

了解您的自發(fā)熒光的光譜也很重要。這可以通過光譜掃描來確定。光譜掃描將有助于實驗優(yōu)化和避免自發(fā)熒光的峰值。

一旦您了解了自發(fā)熒光的光譜，下一個階段就是優(yōu)化熒光標(biāo)記選擇。如果自發(fā)熒光的光譜和您的熒光標(biāo)記的光譜高度重疊，那么您的信號很有可能會被自發(fā)熒光所掩蓋。在這種情況下，選擇一個光譜遠離背景自發(fā)熒光的熒光標(biāo)記。例如，如果您的自發(fā)熒光是在光譜的藍色區(qū)域，將您的熒光標(biāo)記移到綠色或紅色區(qū)域。

選擇熒光團時，選擇新型探針，如Alexa Fluor、Dylight或Atto。這些染料往往更亮，更穩(wěn)定，并且激發(fā)和發(fā)射帶更窄，可以更容易地選擇您的熒光標(biāo)記的信號。如果您的顯微鏡能檢測到它們，遠紅區(qū)染料是避免自發(fā)熒光問題的有效方法，因為這些波長在生物樣品中很少出現(xiàn)。檢測到遠紅染料還有一個好處，就是能夠擴大用于多色實驗的通道數(shù)量。

選擇熒光標(biāo)記后，重要的是不要盲目地用說明書上列出的濃度進行實驗。更多的時候，需要對熒光團進行滴定，在您的樣品上測試不同的濃度。這可以讓您看到哪種濃度能更有效地與背景區(qū)分，并減少自發(fā)熒光產(chǎn)生的干擾。按照制造商的說明，創(chuàng)建一個熒光標(biāo)記的稀釋梯度，以涵蓋略低于和略高于推薦用量的范圍。用您的樣品測試這些稀釋液，以確定哪種稀釋液會給您帶來zui you xiao的信號。

共聚焦顯微鏡的設(shè)置對圖像中的可見信號發(fā)揮著重要的作用，包括自發(fā)熒光。利用這些設(shè)置的優(yōu)勢，通過調(diào)整光譜檢測，盡可能多地切斷自發(fā)熒光信號。根據(jù)顯微鏡的不同，有不同的方法，但最靈活的選擇是選擇一個白激光與光譜檢測器相配合。這樣，您可以精確調(diào)整到達樣品的光的波長，以及通過檢測器的波長。通過這種方式，在選擇哪些信號被記錄在捕獲的圖像中時，可以進行非常精細(xì)的控制，并有足夠的機會消除自發(fā)熒光。

通常自發(fā)熒光不是來自樣品，而是來自成像前的處理方式。例如，封片介質(zhì)、組織培養(yǎng)基和實驗室器皿都可能是自發(fā)熒光的來源。

如果您正在進行活細(xì)胞成像實驗，那么考慮在成像前用預(yù)熱的不含酚紅的培養(yǎng)基或透明的緩沖鹽水代替正常的培養(yǎng)基。除了pH指示劑酚紅（在440納米處被激發(fā)時具有高強度熒光）外，培養(yǎng)基和試劑（如FBS）可能含有許多蛋白質(zhì)和小分子，它們本身具有熒光信號--如果不去除它們，所有這些都會造成強烈的自發(fā)熒光背景。如果您決定將您的細(xì)胞換成一種新的培養(yǎng)基進行活體成像，重要的是要注意這可能會引起細(xì)胞行為和表型的意外變化，所以根據(jù)您的研究內(nèi)容，您可能需要先讓細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

您也可以測量一下您用同一顯微鏡設(shè)置的器皿的自發(fā)熒光，查看是否是自發(fā)熒光的來源。測量時，請嘗試使用帶玻璃底的培養(yǎng)皿或?qū)ｉT用于去除自發(fā)熒光信號的玻璃底皿進行成像。

在對暴露于化學(xué)品的活檢和組織樣本進行成像時也會出現(xiàn)類似的問題。一個常見的例子是消化道，如果它被暴露在抗生素（如四環(huán)素）中，會有大量的自發(fā)熒光，這些抗生素有強烈的熒光特征。在這種情況下，通過用緩沖鹽水che di沖洗或謹(jǐn)慎使用溶劑，可以很容易去除熒光。

如果您要固定細(xì)胞，固定方法會對自發(fā)熒光有很大影響。考慮用福爾馬林和戊二醛的替代品，并且在成像前盡量不要將固定的樣品存放太久，因為自發(fā)熒光會隨著時間的推移而增加。

雖然zui li xiang的方式是通過實驗設(shè)計消除自發(fā)熒光，但有些時候這是無法實現(xiàn)的。在這些情況下，可以通過計算來解決您的自發(fā)熒光問題。使用您的顯微鏡軟件或開源解決方案，如ImageJ，可以分析含有自發(fā)熒光的像素，并嘗試從整個圖像中消除自發(fā)熒光^[1]。但要注意的是，計算方法可能很復(fù)雜。有許多不同的方法和算法可供選擇，所以可以嘗試查看哪些方法xiao guo zui hao。重要的是要記住，這些方法往往會降低您的熒光體信號的強度以及自發(fā)熒光，所以要小心使用它們，并注意在提高與背景的對比度和降低信號強度之間進行權(quán)衡。

準(zhǔn)備好您的樣品并儲存在冰箱后，似乎任何自發(fā)熒光都會留在那里。雖然在樣品準(zhǔn)備階段消除自發(fā)熒光比較容易，但即使在這個過程的后期階段也肯定可以采取一些步驟。

有許多化學(xué)處理方法可以減弱自發(fā)熒光信號。其中一些是市面上可以買到的，而另一些則可以用普通的實驗室化學(xué)品輕松制備，如peng qing hua na、蘇丹黑B、乙醇銨等^[2,3]。

光漂白在顯微鏡中往往有負(fù)面的含義，在激光調(diào)得稍高的情況下，往往會在花費大量時間尋找最佳圖像后失去熒光信號。然而，對于自發(fā)熒光，漂白可以發(fā)揮有益的幫助。在添加熒光團之前，您可以用高強度LED光處理您的樣品，以漂白所有的背景自發(fā)熒光。之后，您所選擇的熒光標(biāo)記應(yīng)該與漂白后的背景形成更強烈的對比^[4]。

顯微鏡和熒光標(biāo)記技術(shù)在不斷進步的同時也考慮到了自發(fā)熒光。有兩項創(chuàng)新在商業(yè)共聚焦顯微鏡中正變得越來越容易使用。

在減少自發(fā)熒光方面，白激光（WLL）具有很大的靈活性。首先，它們使您能夠精細(xì)地調(diào)整激發(fā)波長，以匹配您所選擇的熒光團，同時補充您的樣品的自發(fā)熒光特征。

白激光在選擇熒光團時也給您大的靈活性，因為理論上它們可以讓您在整個光譜范圍內(nèi)使用所有已知的熒光染料。波長從440 nm一直到遠紅端（790 nm），在處理自發(fā)熒光時，激發(fā)新型遠紅熒光標(biāo)記的能力特別有利，因為自發(fā)熒光更常見于光譜的藍色和綠色帶。

最后，基于光纖的WLL技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖激發(fā)，因此，您可以在脈沖之間的非常短的間隔內(nèi)記錄熒光信號（計數(shù)光子）。這是時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）的一個基本要求--熒光壽命分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法。有了WLL，F(xiàn)LIM可以內(nèi)置于您的顯微鏡中，為減少自發(fā)熒光和提高圖像對比度提供了一個非常有效和相對簡單的方法。

熒光壽命成像方法可用于消除自發(fā)熒光。壽命測量不是僅僅依靠特定波長下的熒光強度，而是反映熒光團在激發(fā)狀態(tài)下所花費的時間，這通常是納秒級的時間。這可以發(fā)揮重要的作用，因為您的背景自發(fā)熒光和您的熒光標(biāo)記有重疊光譜的幾率相對較高。然而，它們具有相同的壽命信號的幾率要小得多。這意味著壽命測量可以用來區(qū)分自發(fā)熒光和熒光標(biāo)記信號，即使它們看起來在同一光譜范圍內(nèi)。以這種方式區(qū)分熒光信號，意味著使用壽命測量可以從幾乎任何熒光信號中收集有意義的信息，甚至是自發(fā)熒光。雖然壽命測量在傳統(tǒng)上是一種相對復(fù)雜的技術(shù)，但硬件和軟件的改進使其更容易被納入任何共聚焦顯微鏡的工作流程。

參考文獻

1，J. M. Powell, N. W. Plummer, E. L. Scappini, C. J. Tucker and a. P. Jensen, ?DEFiNE: A Method for Enhancement and Quantification of Fluorescently Labeled Axons,“ Front Neuroanat, 2018.