熒光蛋白簡介

GFP（綠色熒光蛋白）或其變體的光譜特性取決于構(gòu)成發(fā)色團(tuán)的氨基酸結(jié)構(gòu)（圖 1）^[2]。這可能是位于 65-67 位的三個(gè)氨基酸或靠近該位置的殘基（如 YFP）。除了有關(guān)發(fā)色團(tuán)的主要突變外，還進(jìn)行了其他定點(diǎn)誘變研究，以改善蛋白質(zhì)成熟和在異源細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)等其他因素（如密碼子使用、蛋白質(zhì)在生理溫度下的折疊）。請注意，維多利亞甲蟲是一種相對原始的外溫海洋生物，沒有調(diào)節(jié)體溫的生理系統(tǒng)。

盡管 GFP 因其亮度和高光穩(wěn)定性而成為zuishouhuanying的熒光粉之一，但它也有兩個(gè)主要缺點(diǎn)：對 pH 值有一定的敏感性和輕微的二聚傾向。二聚化或寡聚化是許多 FP 的一個(gè)問題。它們相互凝集的傾向會產(chǎn)生假象或誤解融合蛋白的位置和功能。不過，科學(xué)家們也找到了一些解決這一問題的辦法。在關(guān)鍵位置（F223R、L221K 和 A206K）的非極性氨基酸被親水性氨基酸取代后，二聚化程度降低^[3]。所有能改善光譜和實(shí)際特性的基因改變都被歸納為"增強(qiáng)型"FP。

就 wtGFP 而言，增強(qiáng)后的 EGFP（增強(qiáng)型 GFP）在 488 納米波長處只有一個(gè)激發(fā)峰，而不是以前在 395 納米波長和 475 納米波長處的復(fù)雜吸收光譜^[2,3]。Roger Heim、Douglas Prasher 和 Roger Tsien 開發(fā)的第一種 wtGFP 突變體（S65T 突變體）的亮度是原來的五倍，而且成熟時(shí)間更短^[3]。加上另一個(gè)突變體（F64L）在 37°C 溫度下的成熟效率更高，這對于觀察活細(xì)胞的人來說具有重要作用。

藍(lán)寶石（Sapphire）^[3]是一個(gè)非常有趣的 GFP 變體，它的斯托克斯位移最大?？拷l(fā)色團(tuán)的一個(gè)位置發(fā)生了突變（T203I），導(dǎo)致激發(fā)最大值變?yōu)?399 納米，發(fā)射最大值變?yōu)?511 納米。這就是 112 納米的斯托克斯偏移。Emerald 是另一種  GFP 改造品，它能提高光穩(wěn)定性和亮度，并能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更有效地折疊^[3]。

所有綠色熒光蛋白都具有相對較高的亮度，而藍(lán)色熒光蛋白在顯微應(yīng)用中通常會降低發(fā)射強(qiáng)度。盡管如此，由于具有其他光譜特性，它們?nèi)员挥糜诠鈱W(xué)檢測。EBFP（增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白）是通過對 wtGFP 進(jìn)行幾輪突變而構(gòu)建的^[3]。第一個(gè)突變（Y66H）使發(fā)射峰從綠色變?yōu)樗{(lán)色。隨后更多的突變產(chǎn)生了一種激發(fā)最大波長為 380 納米、發(fā)射最大波長為 448 納米的蛋白質(zhì)。這些光譜特性使其成為 EGFP 在 FRET 顯微鏡下的搭檔。最近，Azurite，SBFP2和 EBFP2 等藍(lán)色熒光蛋白具有更高的量子產(chǎn)率和更好的光穩(wěn)定性^[3]。EBFP 的后繼者是一種名為 Sirius 的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)對 pH 值的耐受性非常高（在 pH 值 3 到 9 之間都很穩(wěn)定），而且是迄今為止發(fā)射波長最短的熒光蛋白，因此很受歡迎^[3]。

第二類 "藍(lán)色" GFP 變體是由青色熒光蛋白 (CFPs)形成的^[3]。用色氨酸取代酪氨酸（Y66W）并進(jìn)一步改變基因，可產(chǎn)生亮度和光穩(wěn)定性更好的熒光色素。這種 ECFP 在 433/445 納米和 475/503 納米具有雙峰激發(fā)和發(fā)射光譜。亮度僅為 EGFP 的 40%。Cerulean 是 ECFP 的一個(gè)重要變體，它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率 ^[3]。它的亮度是 ECFP 的 1.5 倍，被用作 YFP 的 FRET 伴侶。

GFP 的突變并不直接改變發(fā)色團(tuán)三個(gè)中心氨基酸中的一個(gè)，因此出現(xiàn)了黃色熒光蛋白（YFP）^[3]。YFP 在 203 位有一個(gè)共同的蘇氨酸，該位置被一個(gè)酪氨酸（T203Y）取代。該氨基酸是 β 管的一部分，靠近發(fā)色團(tuán)。與 GFP 相比，EYFP 的激發(fā)和發(fā)射特性已轉(zhuǎn)向更長的波長，其激發(fā)和發(fā)射最大值分別為 514 納米和 527 納米（EYFP）。EYFP 的一個(gè)特點(diǎn)是對 pH 值敏感。在 pH 值為 6.5 時(shí)，EYFP 只有約 50%的熒光，但這并不總是一個(gè)缺點(diǎn)。在測量 pH 值（如囊泡、內(nèi)體等）時(shí)，EYFP 可用作指示劑。有趣的是，進(jìn)一步的突變（Q69M）產(chǎn)生了更好的酸穩(wěn)定性并顯著提高了亮度（比 EGFP 亮 75%）。與 EGFP 相比，這種蛋白質(zhì)的光穩(wěn)定性仍然較差，因此被稱為Citrine ^[3]。另一種 YFP 突變體（F46L）的成熟速度大大加快，耐酸堿性也有所提高。這種蛋白質(zhì)被命名為 Venus，是 Cerulean 的一種常見 FRET 受體 ^[3]。

如上圖所示，來自維多利亞水母的大多數(shù)熒光蛋白發(fā)出的光譜為藍(lán)色至黃色。紅色熒光蛋白則不見蹤影。俄羅斯科學(xué)家謝爾蓋-盧基揚(yáng)諾夫（Sergey Lukyanov）發(fā)現(xiàn)了擬水螅中的熒光蛋白，tianbu了這一空白^[4]。與其他熒光蛋白相比，紅色熒光蛋白（RFPs）具有很大的優(yōu)勢，因?yàn)樵诠庾V的紅色部分，細(xì)胞中的自發(fā)熒光要少得多^[3]。此外，它們能被較長的波長激發(fā)，這對活細(xì)胞更有利，因?yàn)檩^短波長的光對標(biāo)本的損害更大。與水母蛋白相比，珊瑚蛋白的另一個(gè)普遍優(yōu)勢是它們能在 37°C 溫度下高效成熟。維多利亞A. GFP及其衍生物必須經(jīng)過基因改造才能以正確的方式折疊，而動(dòng)物蛋白的成熟則無需分子工程。這可能是由于其生物群落的水溫較高。

在擬水生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一種 FPs，也是目前使用最多的 FPs 之一是 DsRed^[3]。其名稱來源于?？?Discosoma striata。DsRed 的激發(fā)最大波長為 558 nm，發(fā)射峰值為 583 nm。然而，當(dāng)其結(jié)構(gòu)信息公布后，最初的興奮就停滯不前了。DsRed 的成熟速度比水母 FP 慢得多，并且有一個(gè)中間發(fā)色團(tuán)階段。這一階段發(fā)出的光為綠色光譜，會與其他 FP 重疊。GFP 部分已經(jīng)提到，DsRed 還有另一個(gè)問題。?？t色熒光蛋白是一種強(qiáng)制性四聚體，容易形成寡聚體。這可能導(dǎo)致對融合蛋白的位置和功能產(chǎn)生誤解。一般來說，安氏無脊椎動(dòng)物的 FPs 與維多利亞無脊椎動(dòng)物的 FPs 具有相似的結(jié)構(gòu)。發(fā)色團(tuán)隱藏在大小為 4 nm x 3 nm（高 x 直徑）的 β 管狀結(jié)構(gòu)中。不同之處在于安氏囊蟲的 β-桶狀結(jié)構(gòu)更像橢圓形（圖 2）。

在 GFP "進(jìn)化" 的同時(shí)，研究人員開始對原始 DsRed 進(jìn)行改造，以克服其結(jié)構(gòu)缺陷。第二代 DsRed--DsRed2--減少了寡聚體的形成趨勢，加快了成熟速度，最大限度地減少了綠色發(fā)光的中間階段^[3]。進(jìn)一步的誘變導(dǎo)致紅色 FP wanquan失去了四聚體狀態(tài)，但也喪失了部分量子產(chǎn)率（DsRed2 的 25%）。錢氏實(shí)驗(yàn)室的這項(xiàng)工作產(chǎn)生了第一個(gè)單體紅色熒光蛋白，因此他們稱之為 mRFP1 ^[3]。

隨后，以這種 mRFP1 為起點(diǎn)，產(chǎn)生了一組六種單體 FP，統(tǒng)稱為 "mFruit" ^[3]。它們各自的名稱源自其發(fā)射顏色：mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。mCherry 是這些 FPs 中最有用的一種，它在 610 納米范圍內(nèi)發(fā)光，亮度是 EGFP 的 50%。

迄今為止最耀眼的 FP 是 mFruit 派系的追隨者，名為 tdTomato ^[3]。在基因改變之前，dTomato 是一種強(qiáng)制性二聚體，但通過將兩個(gè)二聚化伙伴放在一個(gè)分子中，避免了二聚化。兩個(gè) dTomato 單元通過 12 個(gè)氨基酸連接體耦合，形成串聯(lián)二聚體 FP tdTomato，其發(fā)射最大值為 581 納米，在光譜的最高區(qū)域具有光穩(wěn)定性。

mPlum是所有 mFruit 蛋白中紅色發(fā)射最深的一種，發(fā)射波長為 649 nm ^[3]。

科學(xué)上使用的綠色熒光類動(dòng)物蛋白數(shù)量非常少，這并不令人驚訝，因?yàn)槲覀円呀?jīng)有了zhongsuozhouzhi，使用方便的維多利亞蟲 GFP。顯然，沒有人認(rèn)為有必要建立一種新的綠色熒光蛋白。盡管如此，還是有一些新的綠色熒光蛋白出現(xiàn)了，比如石珊瑚中的一種明亮熒光蛋白--Azami Green ^[3]。有趣的是，它與 EGFP 的序列同源性不到 6%。

Katushka 是一種對深部組織成像具有重大影響的擬態(tài)熒光蛋白 ^[3]。通過對來自 E. quadricolor 的 RFPs 進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn) Katushka 是一種二聚體蛋白，在 635 納米波長處具有最大發(fā)射亮度，是所有深紅色熒光蛋白中亮度zuigao的。Katushka的單體形式被稱為 mKate，后來被提供了更高亮度的 mKate2 ^[3]。

總之，今天用于顯微應(yīng)用的所有熒光蛋白都來自原始海洋生物。表 1 列出了最重要的熒光蛋白及其相關(guān)光譜特性，如激發(fā)和發(fā)射最大值、光穩(wěn)定性、量子產(chǎn)率和亮度。

一個(gè)非常有趣的故事是，人們發(fā)現(xiàn)了一種由脊椎動(dòng)物表達(dá)的 FP。文昌魚（Amphioxus）是一種小型魚類海洋脊索動(dòng)物，在其前端產(chǎn)生AmphiGFP ^[3]。對該 FP 的序列分析表明，它具有典型的 β-桶狀結(jié)構(gòu)，似乎與橈足類 Pontellina plumata（甲殼動(dòng)物）的 CopGFP有關(guān) ^[5]。這一發(fā)現(xiàn)表明，熒光現(xiàn)象并不局限于原始無脊椎動(dòng)物，在更高進(jìn)化階段的動(dòng)物中也能發(fā)現(xiàn)。此外，這一發(fā)現(xiàn)還表明，熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、改造和增強(qiáng)過程仍在繼續(xù)，這也是目前的熱門研究課題。這一事實(shí)證明了熒光蛋白對當(dāng)前和未來生命科學(xué)研究的重要性和巨大影響。