徠卡175周年：落射熒光顯微鏡和反射對(duì)比顯微鏡

熒光既可以是生物和無(wú)機(jī)結(jié)構(gòu)的自發(fā)熒光，也可以是用特殊染料（熒光染料、熒光標(biāo)記）處理標(biāo)本后產(chǎn)生的所謂二次熒光 ^[1-3]。要在顯微鏡中進(jìn)行熒光成像，必須滿足以下要求：強(qiáng)光源（LED 或氣弧燈）、用于準(zhǔn)確選擇激發(fā)和發(fā)射光的適當(dāng)透射濾光系統(tǒng)，以及適合的熒光成像的光學(xué)部件，即聚光鏡、照明部件、分光鏡、物鏡、鏡筒透鏡、目鏡和照相機(jī) ^[4]。使用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)可以進(jìn)行多光子熒光顯微鏡觀察，使用比發(fā)射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的 2 個(gè)或更多光子進(jìn)行激發(fā)^[5]。

與今天相比，熒光顯微鏡的shouci應(yīng)用是在透射光和暗視野顯微鏡的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這是因?yàn)楫?dāng)時(shí)熒光顯微鏡的應(yīng)用范圍有限。但是，隨著熒光顯微鏡在組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和免疫診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用日益重要，人們?cè)絹?lái)越需要從根本上改進(jìn)照明和觀察技術(shù)。這一需求催生了落射光顯微鏡或入射光熒光顯微鏡的誕生 ^[6]。

經(jīng)過(guò)近 40 年的發(fā)展和改進(jìn)，這項(xiàng)技術(shù)已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域常規(guī)和研究工作的基本工具之一。入射光熒光顯微技術(shù)的進(jìn)步主要得益于 Ploem 小組的研究工作及其yinlin潮流的作用，同時(shí)也得益于 Leitz（現(xiàn)為 Leica Microsystems）在開(kāi)發(fā)所需光學(xué)儀器方面的前瞻性戰(zhàn)略。

本文將介紹這一發(fā)展歷程。

圖 1：a) 熒光多波長(zhǎng)落射光源，四個(gè)二向色鏡安裝在滑塊中，用于紫外、紫光、藍(lán)光和綠光激發(fā)光的入射照明。b) Leitz 多波長(zhǎng)落射光源原型（未商業(yè)化），帶有四個(gè)安裝在滑塊中的二向色鏡^[20]。

很快，人們發(fā)現(xiàn)使用窄波段藍(lán)光和綠光激發(fā)為檢測(cè)廣泛使用的免疫熒光標(biāo)記--異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）提供了最佳可能性。使用藍(lán)光和綠光激發(fā)還能最大限度地減少組織成分的自發(fā)熒光，這是傳統(tǒng)的紫外線透射照明達(dá)不到的效果。現(xiàn)在，F(xiàn)ITC 可以使用窄帶藍(lán)光（使用半寬為 16 納米的帶干擾濾光片）激發(fā)，接近 490 納米（長(zhǎng)藍(lán)波長(zhǎng)）的激發(fā)最大值，并能清楚地觀察到 520 納米的綠色熒光發(fā)射峰。組織成分的自發(fā)熒光被降至zui低（圖 2a 和 b），從而獲得高對(duì)比度。

圖 2：a) 用 FITC 對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，并用寬波段紫外線激發(fā)光照射。b) 與 2a 相同的組織和免疫印跡，使用窄波段藍(lán)光（490 納米）進(jìn)行落射照明。注意圖像對(duì)比度的增加 ^[19]。

將 FITC 激發(fā)至其激發(fā)最大值附近可實(shí)現(xiàn)高效激發(fā)，甚至可以使用在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒(méi)有強(qiáng)發(fā)射峰的汞燈。此外，使用綠色反射二色鏡進(jìn)行落射照明，還shouci實(shí)現(xiàn)了用 546 納米的強(qiáng)汞發(fā)射線激發(fā) Feulgen-pararosaniline （圖 3a 和 b）。

圖 3：a) 肝組織。用 Feulgen-parosanilin 對(duì) DNA 進(jìn)行染色，并用透射綠光觀察細(xì)胞核。這種染色劑被稱(chēng)為吸收性染色劑，不具有熒光性。用窄帶綠光（546 納米）照射其中一個(gè)細(xì)胞核，產(chǎn)生紅色熒光。使用窄波段綠光（546 納米）和反射綠光的二向色鏡進(jìn)行落射。這可能是第一個(gè)用綠光激發(fā)顯微鏡的例子^[19]。注意圖像對(duì)比度大。

圖 4：用于熒光顯微鏡的完整徠茲濾光塊，包含激發(fā)濾光片、二向色鏡和發(fā)射（屏障）濾光片。

由于這種照明部件可將濾光塊快速轉(zhuǎn)入光路，因此對(duì)同一組織切片進(jìn)行多波長(zhǎng)照明成為現(xiàn)實(shí)。此外，用戶還可以更換照明部件中的四個(gè)濾光塊（圖 1c）。用戶可以從許多濾光塊中選擇不同的四組濾光塊進(jìn)行組裝，這些濾光塊包含激發(fā)片、發(fā)射片和二向色鏡的組合，是為不同應(yīng)用而開(kāi)發(fā)的。根據(jù) Ploem 的建議，Leitz 還生產(chǎn)了一種帶落射照明的倒置顯微鏡（圖 5a 和 b）。有關(guān)用于多波長(zhǎng)熒光顯微鏡的 PLOEMOPAK 照明部件的綜述，請(qǐng)參閱 Pluta ^[23] 的綜述。

圖 5：a) 帶有多波長(zhǎng)落射照明部件的徠卡倒置熒光顯微鏡。b) 在移植研究中，用裝有落射照明部件的倒置顯微鏡對(duì)在Terasaki^®塑料皿中的人類(lèi)淋巴細(xì)胞的熒光細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)進(jìn)行成像。c) 8濾光塊的Leitz電動(dòng)落射照明部件。

圖 6：a) 大鼠腸系膜，小血管周?chē)兴{(lán)色熒光腎上腺素能（CA）神經(jīng)叢和黃色熒光肥大細(xì)胞（5-HT）。b) 與 6a 相同的組織和染色，采用落射照明和窄帶紫光激發(fā)光（LP 3 mm、Y 400 和 SP 425 干涉濾光片），495 nm 的二向色鏡反射紫光，以及 LP 460 nm 的屏障濾光片。這個(gè)濾光塊shou次觀察到了藍(lán)色熒光腎上腺素能神經(jīng)纖維，與黃色熒光肥大細(xì)胞截然不同^[25]。

圖 7：用抗 kappa TRITC 結(jié)合物和抗 IgG FITC 結(jié)合物對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色。用窄波段綠光和藍(lán)光外顯，含有 TRITC 的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，含有 FITC 的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。有些細(xì)胞同時(shí)含有 FITC 和 TRITC。

圖 8： "蓮座狀 "的人類(lèi)血細(xì)胞。用紫外光落射照射用藍(lán)色熒光染料石炭酸染色的紅細(xì)胞。曙紅染色的淋巴細(xì)胞經(jīng)綠光激發(fā)后用發(fā)射出橘紅色的熒光^[19]。

在落射照明中，使用二向色鏡將入射光偏轉(zhuǎn)到樣本上。二向色鏡的光譜特性是這樣設(shè)計(jì)的：只有所需的激發(fā)波長(zhǎng)才能通過(guò)物鏡向下偏轉(zhuǎn)到樣本上，而不需要的波長(zhǎng)則會(huì)被二向色鏡透射并收集到二向色鏡后面的光阱中^[21]。消除這些不需要的激發(fā)光可顯著減少雜散光，從而提高圖像對(duì)比度。二色鏡可將所需的（短波長(zhǎng)）激發(fā)光通過(guò)物鏡偏轉(zhuǎn)到樣本上，但對(duì)較長(zhǎng)的熒光波長(zhǎng)是透明的。抑制濾光片（屏障濾光片）可吸收（或反射）從標(biāo)本和物鏡透鏡表面反射的激發(fā)光，但對(duì)熒光高度透明，熒光隨后可到達(dá)目鏡或相機(jī)傳感器。落射照明的效率與物鏡數(shù)值孔徑（NA）的四次方有關(guān)，物鏡首先用作聚光器，然后作為聚光鏡用于觀察。在第一臺(tái)多波長(zhǎng)落射照明設(shè)備上市時(shí)，只有高 NA（0.95、1.30）的高倍率物鏡（70x、100x）可供選擇。根據(jù) Ploem ^[19,20]的建議，Leitz 成為diyi家生產(chǎn)中等功率物鏡的制造商，如 NA 為 1.30 的油浸 40x 物鏡（圖 9）。這種新型物鏡專(zhuān)為落射照明熒光顯微鏡而設(shè)計(jì)，可產(chǎn)生非常明亮的圖像，從而縮短了常規(guī)熒光顯微攝影的曝光時(shí)間。

圖 9：早期的 Leitz 40x 油浸物鏡原型（"Versuchs"），NA 值為 1.30，用于熒光落射照明技術(shù)的試驗(yàn)^[20]。

在過(guò)去的十年中，分子生物學(xué)的應(yīng)用急劇增加，因此開(kāi)發(fā)出了許多適用于各種應(yīng)用的濾光片組合，其被安裝在各種濾光塊支架中。熒光落射照明可通過(guò)手動(dòng)或電動(dòng)方式切換2至8個(gè)濾光塊。在此不對(duì)各種濾光快的多種應(yīng)用進(jìn)行全面詳細(xì)的討論。

圖 10：使用反射-對(duì)比顯微鏡（RCM）觀察和拍攝的附著在載玻片上的被單克隆抗體標(biāo)記的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。單克隆抗體對(duì)該樣本的表面抗原進(jìn)行了標(biāo)記，然后使用了免疫過(guò)氧化物酶染色。由于DABox染料的強(qiáng)反射，可以看到在普通顯微鏡下無(wú)法觀察到的細(xì)胞突起的細(xì)長(zhǎng)部分。

圖 11：用過(guò)氧化物酶 DAB 染色法制備的腎組織超薄切片（約 35 納米厚）。與熒光顯微鏡相比，用反射對(duì)比顯微鏡觀察腎小球的線性染色模式能獲得更清晰的圖像。

電子顯微鏡（EM）中使用的大多數(shù)免疫染色物質(zhì)的強(qiáng)反射提供了如此高對(duì)比度，以至于這種染色可以與許多經(jīng)典的（吸收性的）組織化學(xué)染色物質(zhì)結(jié)合在一起，用于顯示適度強(qiáng)反射的重要大分子。后者的染色通常用于增強(qiáng)細(xì)微的形態(tài)定位，并且在許多情況下，比僅使用熒光標(biāo)記物更精確地確定了免疫標(biāo)記物的位置。此外，這樣的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果可以通過(guò)使用具有相同免疫染色的下一個(gè)超薄切片進(jìn)行電子顯微鏡檢查來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。

圖 12：用于反射對(duì)比顯微鏡的濾光塊包含一個(gè)偏振鏡、一個(gè)中性（50%）分光鏡和一個(gè)分析器。該濾光塊可插入 Leica 熒光顯微鏡中落射照明部件的一個(gè)位置。

通過(guò)共聚焦激光掃描顯微技術(shù)，可以在不需要特殊物鏡或其他減少雜散光光學(xué)措施的情況下執(zhí)行反射式對(duì)比顯微（RCM），得益于通過(guò)小孔照明消除雜散光的效果。大多數(shù)具有吸收特性的免疫染色劑對(duì)激光有著非常強(qiáng)的反射作用，并且其褪色現(xiàn)象極為有限。這些染色劑常允許采用更小的小孔尺寸（例如，10微米），此尺寸比在共聚焦熒光激光掃描顯微中使用的大多數(shù)熒光染料所能接受的小孔尺寸小（為其五分之一到十分之一）。因此，反射型免疫標(biāo)記的使用可顯著提高光學(xué)分辨率。使用熒光染料雙重染色并通過(guò)Leica共聚焦激光掃描顯微鏡成像的樣本，提供了同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記物和一個(gè)反射型免疫標(biāo)記物的可能性。

RCM 使用熒光顯微鏡架、落射照明部件和高強(qiáng)度光源（如氣體弧光燈）。在熒光落射照明部件中，必須插入一個(gè)額外的偏振濾光塊，其包含偏振片、反射器和分析器（圖 12）。此外，還必須將反射對(duì)比（RC）光闌模塊（包含中央光闌系統(tǒng)）置于入射光路徑中。該RC光闌模塊適配具有中央光闌和/或孔徑光闌的滑動(dòng)組。此外，應(yīng)該將專(zhuān)門(mén)為反射對(duì)比顯微鏡開(kāi)發(fā)的特殊目鏡添加到顯微鏡目鏡套裝中。

反射光顯微鏡的對(duì)比度基于反射強(qiáng)度（反射率）的差異。對(duì)于這種顯微鏡，光的反射發(fā)生在每一個(gè)光學(xué)邊界，即當(dāng)折射率和/或吸收率發(fā)生變化時(shí)。對(duì)于反射率小于 1%（大部分小于 0.2%）的生物標(biāo)本，由于顯微鏡管內(nèi)存在不必要的反射，因此使用傳統(tǒng)顯微鏡幾乎不可能獲得反射光圖像。 第一種方法是在入射光路徑上與物鏡后焦平面（孔徑）相接的平面上插入中心擋片（帶有中心擋片的光圈光闌，形成環(huán)形孔徑），使入射光成為環(huán)形光錐。第二種方法是使用“防反射"方法減少不必要的散射光或反射光。通過(guò)使用交叉偏振片來(lái)抑制顯微鏡內(nèi)部的反射光，從而使只有從標(biāo)本反射的光才能傳遞到目鏡或相機(jī)傳感器。因此，物鏡的前透鏡上裝有四分之一波板。光線通過(guò)四分之一波板時(shí)（向下到達(dá)樣本，從樣本反射后向上），光線的偏振方向會(huì)改變?yōu)?2 x 45° = 90°。

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