光片顯微鏡中的光束選擇

在光片顯微鏡中，主瓣是指光片中強(qiáng)度最高的區(qū)域，它直接影響著顯微鏡的軸向分辨率。主瓣越薄，理論上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整個(gè)光片的厚度，同樣對(duì)成像質(zhì)量有著決定性的影響。光切片不僅包括主瓣，還包括可能影響對(duì)比度的旁瓣或次要結(jié)構(gòu)。

在許多先前的出版物中，未能區(qū)分光片厚度和主瓣厚度可能會(huì)導(dǎo)致混淆，例如在提到“通過(guò)掃描貝塞爾光束產(chǎn)生的超薄平面照明"或“超薄貝塞爾光片"時(shí)，主瓣比相同長(zhǎng)度的傳統(tǒng)高斯光片更薄^【19,25】。對(duì)于zui常用的具有高斯分布的光片來(lái)說(shuō)，只有一個(gè)光片，主瓣厚度和光片厚度的測(cè)量值嚴(yán)格成比例。但如圖1 所示，這對(duì)于具有輔助結(jié)構(gòu)（如側(cè)瓣或多條平行光片）的多瓣光束并不適用。

對(duì)于多瓣光束，當(dāng)僅考慮主瓣厚度時(shí)，樣品暴露的總照明功率中有相當(dāng)一部分被忽略。這種額外的曝光會(huì)在光片顯微鏡中貢獻(xiàn)到檢測(cè)到的熒光信號(hào)，從而可能降低圖像對(duì)比度。因此，考慮以下幾點(diǎn)非常重要：通常顯示的沿檢測(cè)軸的 PSF 切片可以用來(lái)推斷軸向分辨率。然而，它們使觀察者無(wú)法計(jì)光學(xué)分層性能或光片厚度。

激光強(qiáng)度是生成光片的基礎(chǔ)。不同強(qiáng)度的激光可以產(chǎn)生不同特性的光片。例如，高強(qiáng)度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加樣品的光漂白和光毒性。

圖 2. 主峰厚度和光學(xué)分層的定義。展示了單峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的強(qiáng)度在 yz 方向上的橫截面。在焦點(diǎn)處 (紫色線) 和距離 y = L 處 (厚度加倍的地方, 藍(lán)色線) 的相應(yīng)剖面顯示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分別說(shuō)明了單峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定義為在焦點(diǎn)處強(qiáng)度高于最大強(qiáng)度 37% 的范圍，分別在焦點(diǎn)處 (c, e) 和距離 y = L 處 (d, f)。子圖 g-j 相應(yīng)地說(shuō)明了光學(xué)切片厚度 wOS ，定義為包含光束功率 63% 的范圍。

觀察由掃描光束形成的光片時(shí)，相關(guān)的測(cè)量包括：

第一個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)提供軸向分辨率，而第二個(gè)提供對(duì)比度。軸向分辨率是沿檢測(cè) z 軸可以分辨出兩個(gè)物體的最小距離。對(duì)比度是聚焦特征信號(hào)與背景信號(hào)（主要來(lái)自失焦特征）的差異。圖 2a 顯示了由單峰光束形成的光片的示例。圖 2c 和 2d 顯示了在光束傳播軸上兩個(gè)位置處以 1/e=37% 峰值強(qiáng)度測(cè)量的分布寬度，圖 2g 和 2h 顯示了標(biāo)記光束總能量 63% 的積分輪廓。在強(qiáng)度大于峰值強(qiáng)度 37% 的范圍內(nèi)，高斯強(qiáng)度分布的光片攜帶其總能量的 84%。原因在于光片不是一個(gè)圓對(duì)稱光束，而是主要沿檢測(cè)軸向一個(gè)方向擴(kuò)展。

在比較不同光片時(shí)，第一個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)（強(qiáng)度下降）與第二個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)（區(qū)域內(nèi)包含的能量）之間的比例與任何長(zhǎng)度的單峰光片的比例數(shù)值無(wú)關(guān)。

對(duì)于多峰光片來(lái)說(shuō)，第一個(gè)和第二個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)得到的值可能會(huì)有顯著差異，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。如圖 2 右側(cè)所示，強(qiáng)度分布降到峰值的 1/e 的距離僅反映了主峰的厚度（圖 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度"這個(gè)術(shù)語(yǔ)來(lái)表示這個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。圖 2i, j 中標(biāo)示的光學(xué)分層 w_OS 考慮到主峰可能不具備足夠的能量來(lái)貢獻(xiàn)總檢測(cè)信號(hào)的 63%。

這一測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)給出的值明顯大于主峰厚度，更接近反映了光片的真實(shí)厚度。

在實(shí)際應(yīng)用中，這些性能參數(shù)之間存在著協(xié)同與權(quán)衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要犧牲一些光切片的均勻性，從而影響對(duì)比度。同樣，增加激光強(qiáng)度以改善信噪比，也可能帶來(lái)光漂白的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2. 各種光束類型相對(duì)于高斯光束的光學(xué)分層（藍(lán)色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均為光束長(zhǎng)度 L 約為 30 µm 計(jì)算得出。插圖顯示了解釋圖表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光學(xué)分層比高斯光束更厚。

對(duì)于所有類型的光片顯微鏡，光學(xué)切片和軸向分辨率取決于光片的長(zhǎng)度。因此，僅在長(zhǎng)度相等的情況下比較光片特性是至關(guān)重要的。在大多數(shù)情況下，長(zhǎng)度是由樣品或研究人員希望在單幀中觀察的視野決定的。

因此，作者選擇首先定義光片長(zhǎng)度的方法，然后根據(jù)它們提供的軸向分辨率和光學(xué)切片來(lái)比較光片。

將高斯光束設(shè)為參考值，作者計(jì)算了相同光束長(zhǎng)度下不同光束類型在厚度和光學(xué)切片方面的相對(duì)增益或損失。

圖2顯示了長(zhǎng)度為30?µm的光片的結(jié)果。數(shù)值超過(guò)100%表明光片厚度 w_OS 或主瓣寬度w_ML大于高斯光束。

總體而言，作者發(fā)現(xiàn)對(duì)于所有光束類型，在這兩個(gè)特性之間存在權(quán)衡：制造薄光片會(huì)以高斯光束的長(zhǎng)度或其他光片類型的光學(xué)切片為代價(jià)。

光片顯微鏡的技術(shù)選擇是一個(gè)綜合考量的過(guò)程，需要在分辨率、對(duì)比度、光切片質(zhì)量和激光強(qiáng)度之間找到最佳的平衡點(diǎn)。通過(guò)深入理解這些技術(shù)參數(shù)及其相互關(guān)系，您可以更加自信地選擇和優(yōu)化適合自己研究的光片顯微鏡技術(shù)。

* E. Remacha “Light Sheet Simulator" (2019) [retrieved 5 November 2019]

在Matlab環(huán)境中運(yùn)行LightSheet_Simulator.mlapp，圖3顯示了GUI示例。有三種可能的操作：

圖3. 光束模擬器用戶界面

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