顯微課堂 | 清晰對(duì)比、無霧的 3D 樣本實(shí)時(shí)圖像

Computational Clearing是THUNDER成像儀的核心技術(shù)。它檢測并去除每張圖像中的失焦背景，使得感興趣的信號(hào)可以直接獲取。同時(shí)，在清晰聚焦的區(qū)域，邊緣和樣本特征的強(qiáng)度得以保留。當(dāng)使用基于相機(jī)的熒光顯微鏡記錄圖像時(shí)，“不需要的"背景會(huì)與“需要的"清晰結(jié)構(gòu)信號(hào)疊加，并且兩者總是被記錄。為了獲得最佳效果，目標(biāo)是盡可能減少背景。為了從圖像中排除不需要的背景，找到準(zhǔn)確分離背景與所需信號(hào)的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。一般來說，背景在記錄的圖像中表現(xiàn)出特征行為，這與其來源無關(guān)。因此，僅憑其在圖像中的外觀，無法辨別背景的來源。特別是在生物樣本中，背景通常不是恒定的。它在視場（FOV）中是相當(dāng)可變的。Computational Clearing自動(dòng)考慮這一點(diǎn)，使得清晰信號(hào)可以立即獲取。

圖 1：聚焦和失焦 PSF 的示意圖：寬場圖像的 PSF（中）可以有效地通過聚焦的兩個(gè) PSF 分量（左）和失焦的 PSF 分量（右）來描述。背景估計(jì)利用了這樣一個(gè)事實(shí)，即失焦信號(hào)的結(jié)構(gòu)長度尺度S[ ? Iout] 大于相應(yīng)的結(jié)構(gòu)長度尺度r0，該尺度由聚焦信號(hào)的寬度給出。

使用寬場顯微鏡獲取的圖像可以分解為兩個(gè)組成部分：清晰信號(hào)和背景信號(hào)。背景信號(hào)主要來自失焦信號(hào)。因此，寬場圖像 I(r) 可以近似表示為：

其中 psfof/if(r) 和 f(r) 分別是清晰（if）和失焦（of）貢獻(xiàn)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)以及熒光分布。由于失焦 PSF 的寬度遠(yuǎn)大于清晰 PSF，因此在公式 (1) 中，這兩個(gè)貢獻(xiàn)可以通過長度尺度區(qū)分算法（例如小波變換）清晰分開。我們開發(fā)了一種迭代算法來分離這兩個(gè)貢獻(xiàn)。它在每次迭代中計(jì)算以下最小化：

這里S[ ?Iout]表示估計(jì)的失焦貢獻(xiàn)的結(jié)構(gòu)長度尺度Iout。結(jié)構(gòu)長度尺度r0（公式 (2)）是基于系統(tǒng)的光學(xué)參數(shù)計(jì)算的，并且可以進(jìn)行調(diào)整。在LAS X 軟件中，它被稱為“特征"尺度。

使用這種方法，僅去除了背景（BG）。保留了來自感興趣的失焦樣本區(qū)域的信號(hào)和噪聲。由于失焦區(qū)域的噪聲仍然存在，圖像中失焦特征的邊緣是可見的，因此保持了樣本特征與其特征尺度之間的空間關(guān)系。盡管生命科學(xué)樣本中背景的變化特性，特征的相對(duì)強(qiáng)度仍然得以保留。

與傳統(tǒng)的包容性方法不同，使用Computational Clearing揭示的圖像不是生成的，而是從樣本中的背景信號(hào)中“解鎖"的。

圖 2：用 Cy5 標(biāo)記的βIII 微管大鼠神經(jīng)細(xì)胞顯示結(jié)構(gòu)的邊緣，這些結(jié)構(gòu)在Computational Clearing后得以保留，以及結(jié)果背景。圖像是使用THUNDER Imager 3D 細(xì)胞培養(yǎng)顯微成像系統(tǒng)和 HC PL APO 63x/1.40 油鏡頭獲取的。

Computational Clearing去除了背景，清晰地揭示了樣本深處的焦平面。Computational Clearing作為一種的方法，實(shí)際上在與包容性方法結(jié)合使用時(shí)變得更加強(qiáng)大。

THUNDER Imager 提供三種模式供選擇：

即時(shí)Computational Clearing（ICC）是獨(dú)占Computational Clearing方法的同義詞，正如在本技術(shù)說明書開頭介紹的那樣。SVCC 和 LVCC 是獨(dú)占Computational Clearing與基于決策掩模的 3D 去卷積的結(jié)合，專門用于薄樣品（SVCC）或厚樣品（LVCC）。包容性方法的自適應(yīng)圖像信息提取遵循一個(gè)概念，該概念源于 LIGHTNING，徠卡顯微系統(tǒng)的自適應(yīng)去卷積方法，最初為共聚焦顯微鏡開發(fā)。

LIGHTNING 使用決策掩模作為基準(zhǔn)參考，以計(jì)算圖像每個(gè)體素的適當(dāng)參數(shù)集。結(jié)合寬場點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），LIGHTNING 固有的自動(dòng)化自適應(yīng)去卷積過程的功能可以轉(zhuǎn)移到寬場檢測中。

在本節(jié)中，展示了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以證明：

InSpeck 珠子是微球標(biāo)準(zhǔn)，生成一系列明確定義的熒光強(qiáng)度水平，用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線和評(píng)估樣品亮度。在這個(gè)簡短的實(shí)驗(yàn)中，將相同體積的同尺寸熒光珠子和非熒光珠子混合在一起。熒光珠子具有不同的相對(duì)強(qiáng)度，即 100%、35%、14%、3.7%、1% 和 0.3%。

InSpeck 珠子被沉積在載玻片上，并使用 20 倍低 NA 物鏡對(duì) 156 個(gè)位置進(jìn)行了成像（圖 3，單個(gè) z 位置）。記錄了三個(gè)通道（圖 3 從左到右）：明場（BF），相位對(duì)比（PH）和熒光（FLUO）。FLUO 強(qiáng)度經(jīng)過調(diào)整，以避免明亮物體導(dǎo)致相機(jī)傳感器飽和。為了糾正潛在的不均勻照明，使用了視場中心區(qū)域。

使用了 FOV。沒有進(jìn)行進(jìn)一步的平場校正。FLUO 圖像使用即時(shí)Computational Clearing（ICC）進(jìn)行后處理，特征尺度為 2500 nm，與微珠尺寸一致。

珠子是通過簡單閾值處理 PH 圖像找到的。為了糾正錯(cuò)誤檢測到的珠子，僅接受某一大?。?8 到 76 像素）且圓度≥0.99 的圓形物體。該掩膜用于獲取原始熒光和 ICC 處理通道的平均強(qiáng)度。沒有排除強(qiáng)度異常值。為了獲得相對(duì)值，所有接受的珠子的原始和處理強(qiáng)度都除以其最大強(qiáng)度群體的中位強(qiáng)度（通常是 100%相對(duì)強(qiáng)度的熒光珠子）。在圖 4（右）中，黑線顯示，經(jīng)過Computational Clearing后，強(qiáng)度仍然接近預(yù)期值。

結(jié)論：Computational Clearing技術(shù)使得即使是最弱信號(hào)群體的真實(shí)熒光動(dòng)態(tài)也能被區(qū)分，這在原始數(shù)據(jù)中是不可觀察的。使用Computational Clearing技術(shù)時(shí)，發(fā)射強(qiáng)度的量化非常簡單。然而，對(duì)于此類實(shí)驗(yàn)，需要非常嚴(yán)格地遵循定量熒光顯微鏡的良好實(shí)踐。

以下實(shí)驗(yàn)展示了 ICC 如何處理背景中的巨大差異和異質(zhì)性。準(zhǔn)備了一種不同強(qiáng)度的綠色熒光珠群，并將其分散在載玻片上。珠子以混合強(qiáng)度出現(xiàn)，但呈現(xiàn)出簇狀（圖 6，左）。通過從濾光塊中移除激發(fā)濾光片，并用記號(hào)筆在載玻片的一半添加熒光素背景，提供了一般背景。定義了兩個(gè)大小相等的非重疊視場區(qū)域：一個(gè)在熒光素區(qū)域內(nèi)，即高背景瓷磚掃描（圖 5：區(qū)域 A，左），另一個(gè)在沒有熒光素的區(qū)域，即低背景瓷磚掃描（圖 5：區(qū)域 B，右）。

對(duì)于每個(gè)視場，通過簡單的閾值處理 BF 圖像（圖 6，左）來識(shí)別珠子。從這個(gè)掩膜中獲得原始圖像和 ICC 處理圖像的平均熒光強(qiáng)度。

不符合特定圓度和大小的物體被丟棄，未用于進(jìn)一步分析。沒有應(yīng)用其他異常值修正。總共在區(qū)域 A（高且不均勻背景）中識(shí)別出 39,337 個(gè)物體，在區(qū)域 B（低背景）中識(shí)別出 43,031 個(gè)物體。用于后續(xù)比較的強(qiáng)度，從區(qū)域 A 隨機(jī)選擇 39,337 個(gè)物體，以使兩個(gè)區(qū)域的樣本大小匹配。

區(qū)域 A（高背景）和 B（低背景）中物體的強(qiáng)度分布非常不同（Kolmogorov Smirnov 距離：0.79±0.2，置換重采樣）?？梢钥吹揭话愕钠坪吞砑拥谋尘埃▓D 7，左側(cè)藍(lán)色）。在Computational Clearing后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行的相同分析顯示兩個(gè)區(qū)域的分布非常相似（KS：0.05±0.02）。

結(jié)論：Computational Clearing可以處理圖像數(shù)據(jù)中固有的異質(zhì)背景信號(hào)，這些信號(hào)在真實(shí)生物樣本中是普遍存在的。此外，它允許在不需要繁瑣的局部背景去除算法的情況下量化熒光信號(hào)，這些算法通常需要為每個(gè)成像會(huì)話進(jìn)行調(diào)整（即使是對(duì)于同一物體）。

為進(jìn)一步展示 ICC 的線性行為，記錄了在固定視場內(nèi)穩(wěn)定熒光物體（15 微米珠子）在不同曝光時(shí)間下的圖像。為了排除照明啟動(dòng)效應(yīng)，物體始終用激發(fā)光照明。由于珠子的低密度和平坦性，原始圖像中的背景主要來自相機(jī)偏移。ICC 參數(shù)根據(jù)物體大小設(shè)置：15 微米，強(qiáng)度最高（100%）。

圖 8：原始圖像（上排）和使用Computational Clearing（下排）在不同曝光時(shí)間（列）下拍攝的圖像，按各自的曝光時(shí)間進(jìn)行劃分。綠色點(diǎn)：用于進(jìn)一步分析的物體。紅色方框：傳統(tǒng)背景減法的區(qū)域。比例尺：100 微米。

最后，ICC 與傳統(tǒng)的 BG 減去數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。這一步通常是量化強(qiáng)度的必要步驟。計(jì)算了每幅圖像中無對(duì)象區(qū)域（100 x 100 像素，如圖 8 中紅色方框所示）的平均強(qiáng)度，并從同一圖像的強(qiáng)度數(shù)據(jù)中減去。繪制先前找到的對(duì)象的平均強(qiáng)度與傳統(tǒng) BG 減去的原始數(shù)據(jù)的關(guān)系。

顯示 ICC 給出了相同的結(jié)果（圖 9，右側(cè)）。結(jié)論：ICC 表現(xiàn)出線性行為。它使數(shù)據(jù)量化成為可能，而無需進(jìn)一步的圖像處理，這在背景異質(zhì)性較強(qiáng)時(shí)尤其繁瑣。

可成像的最大深度高度依賴于樣本。熒光團(tuán)的密度、吸收或樣本內(nèi)局部折射率的均勻性等因素直接影響信噪比和每個(gè)體素的散射光量。這些因素通常會(huì)波動(dòng)，即使在同一視野內(nèi)也是如此。

在基于相機(jī)的系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn) 3D 樣本的光學(xué)切片的經(jīng)典方法是使用多點(diǎn)照明，例如使用尼普科盤或網(wǎng)格投影設(shè)備。后者在網(wǎng)格無法在焦平面上清晰投影時(shí)會(huì)引入偽影。另一方面，基于盤的系統(tǒng)必須處理針孔之間的有限距離，這在某些成像深度引入了來自失焦平面的光污染。

通過Computational Clearing，在足夠透明的樣本中，最大深度主要取決于發(fā)射光的散射。Computational Clearing通過去除散射光成分來實(shí)現(xiàn)深層成像。如果在圖像中至少可以局部獲得一些對(duì)比度，THUNDER成像儀使其變得可訪問。Computational Clearing的一個(gè)大優(yōu)勢是它可以與活體標(biāo)本一起使用，因此成像可以在生理?xiàng)l件下進(jìn)行。

對(duì)比噪聲比越好，重建結(jié)果就越好。對(duì)于圖 10 中所示的例子，使用了大體積Computational Clearing（LVCC），這是一種Computational Clearing和自適應(yīng)去卷積的結(jié)合，用于成像厚樣本體積。在樣本的上層，甚至最細(xì)微的細(xì)節(jié)都能被解析并進(jìn)行分割。盡管在更深層次的分辨率和分割可能會(huì)降低，但在樣本深度為 140 到 150 微米（圖 11）時(shí)，顯示出大量有價(jià)值的細(xì)節(jié)，這些細(xì)節(jié)在原始數(shù)據(jù)中并未顯現(xiàn)。沒有THUNDER，大多數(shù)寬場成像實(shí)驗(yàn)在 50 微米的深度就停止，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為無法獲取更多信息。

圖 11：深度為 140 到 150 微米的最大強(qiáng)度投影。

將小體積Computational Clearing（SVCC）應(yīng)用于單個(gè)、非重疊、衍射極限物體會(huì)導(dǎo)致分辨率增強(qiáng)，如下圖 12 所示。在給定的例子中，成像了一個(gè)直徑為 40 納米的單個(gè)珠子（100 倍，1.45 NA 物鏡），并應(yīng)用了默認(rèn)設(shè)置的 SVCC。結(jié)果是橫向分辨率增強(qiáng)* 2 倍（比率 FWHMX SVCC/Raw = 0.51），縱向分辨率增強(qiáng)超過 2.5 倍（比率 FWHMZ SVCC/Raw = 0.39）。

*分辨率增強(qiáng)被定義為發(fā)光點(diǎn)源的表觀大小。在折射極限以下，無法分離彼此靠近的兩個(gè)結(jié)構(gòu)。

圖 12：單個(gè)珠子的 X 軸（左）和 Z 軸（右）強(qiáng)度測量，尺寸低于光學(xué)分辨率極限：SVCC 之前（藍(lán)點(diǎn)）和 SVCC 之后（紅點(diǎn)）以及擬合的高斯曲線（陰影）。插圖顯示了相應(yīng)的 XY 和平面。