全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)：實時熒光壽命成像的好選擇

本文轉(zhuǎn)載自浙大實驗設(shè)備處公眾號

編者說

大型科研儀器是科研實現(xiàn)原創(chuàng)性突破的利器，開放共享開辟了科技創(chuàng)新的新賽道。為促使我校大型儀器共享與服務水平上一個新的臺階，讓“器"的投入最終在“智"上顯出更廣更大的效應和價值，實驗室與設(shè)備管理處微信公眾號將陸續(xù)推出“大儀說"系列報道，旨在幫助校內(nèi)外用戶深入了解學校大型科研儀器設(shè)備，促進共享與合作。

大儀速寫

傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡以單譜線激光器作為光源，利用不同熒光探針標記生物樣本內(nèi)不同組分，分析熒光強度參數(shù)實現(xiàn)較高的成像對比度和特異性，但檢測結(jié)果易受熒光團濃度、激發(fā)光強度、光漂白等因素影響。熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）不受激發(fā)光強度、熒光團濃度、光漂白等因素影響。熒光壽命與熒光團所處的微環(huán)境密切相關(guān)，能反映微環(huán)境中pH、折射率、離子濃度等變化，是熒光團的固有屬性。通過測量熒光壽命可精準定量不同樣本或?qū)崟r分析處于不同狀態(tài)的生物樣品，獲得與熒光光譜技術(shù)、熒光強度檢測技術(shù)互補的結(jié)構(gòu)與功能信息。熒光壽命測量系統(tǒng)基于激光掃描共聚焦顯微系統(tǒng)（LSCM）的搭建，熒光壽命成像變得高效且簡單。

圖3. 全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)（Stellaris 8 Falcon）

該設(shè)備的工作原理是什么？

該設(shè)備基于倒置激光共聚焦顯微鏡，集成了全光譜連續(xù)可調(diào)脈沖激光器激發(fā)系統(tǒng)，搭載精準光子計數(shù)模式高靈敏混合探測器（HyD），不僅可實現(xiàn)強度成像，也讓熒光壽命成像變得高效且簡單。

熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的平均時間ns。通過觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。測量圖像中所有像素平均光子到達時間，即熒光壽命成像(FLIM）。熒光壽命范圍一般在0.2-20ns之間，反映了熒光分子內(nèi)在屬性和所處微環(huán)境。

圖4. 熒光壽命成像原理

在功能上有什么du特性和先進性？

1）熒光強度測量。配備自由連續(xù)可調(diào)脈沖白激光器，擁有351根激發(fā)譜線，可同時分離8根激光譜線；加上超高靈敏度熒光檢測范圍達850 nm的檢測器。自由選擇染料并同時8色成像，輕松實現(xiàn)一些特殊染料或近紅外染料的快速成像。

2）熒光壽命測量。實現(xiàn)視頻速率的快速熒光壽命成像，可用于監(jiān)測代謝狀態(tài)和微環(huán)境變化、分子間快速相互作用(FLIM-FRET)、膜張力研究（Flipper-TR）、不同壽命組分高效拆分等。

熒光壽命檢測模塊和共聚焦的整合，既能做最基礎(chǔ)的單光子共聚焦成像，又能實現(xiàn)高分辨的高精度特殊多色成像。可在亞細胞水平上檢測Ca²⁺、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。同時具備FLIM熒光壽命成像功能支持多種應用。

該設(shè)備為科學研究帶來哪些新應用？

該設(shè)備是目前功能極為全面的全光譜激光共聚焦成像系統(tǒng)。具備FLIM熒光壽命成像模塊、Lightning高分辨成像模塊、共聚焦常規(guī)模塊（3D、時間、多點、光譜掃描、大視野拼圖）和活細胞孵育系統(tǒng)，除了完成細胞或組織內(nèi)熒光信號的檢測外，還可開展FLIM熒光壽命成像，F(xiàn)LIM-FRET、組分分析分離、局部離子濃度、微環(huán)境(如pH值)、區(qū)分光譜近似的染料、區(qū)分染料和自發(fā)熒光等多種普通共聚焦無法實現(xiàn)的gao端實驗。

在傳統(tǒng)熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎(chǔ)上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度，大大拓展了該系統(tǒng)在細胞生物學、生物化學、生理學、神經(jīng)生物學等眾多學科中的應用。

目前有哪些應用案例?

在功能成像領(lǐng)域中，監(jiān)測小分子、離子或電勢的動態(tài)變化，通常是用熒光探針來完成，其中多數(shù)顯示出強度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì)，并在活細胞中表達這些構(gòu)建體。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽，它們與所需的分析物（如Ca²⁺）結(jié)合，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白。結(jié)合分析物后，肽發(fā)生構(gòu)象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac。

這臺設(shè)備開放共享情況如何？可以通過什么途徑聯(lián)系使用它？

全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)自2023年6月引進正式投入使用以來，已服務浙江大學醫(yī)學院、藥學院、生命科學學院、農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院、化學工程與生物工程學院、附屬醫(yī)院等校內(nèi)外多家單位，累計機時近兩千小時，培訓師生近百人。未來，我們希望繼續(xù)提高設(shè)備利用率，加強開放共享，更好的服務廣大科研用戶，期待與更多單位開展合作研究。

如果需要使用這臺儀器，可登入浙江大學醫(yī)學院公共技術(shù)平臺網(wǎng)站或聯(lián)系楊老師進行預約。

內(nèi)容來源：醫(yī)學院公共技術(shù)平臺

今日編輯：張雨樓