Cell：SP8 STED 納米顯微鏡對(duì)人瘧疾感染初期關(guān)鍵蛋白的鑒定

瘧疾是一種威脅生命的疾病，通過(guò)被原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的蚊子叮咬傳播。常見(jiàn)和危險(xiǎn)的瘧疾類(lèi)型是惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum）引起的瘧疾。瘧疾引起了嚴(yán)重關(guān)切，因?yàn)槭澜缟嫌幸话氲娜丝谔幱谶@種危險(xiǎn)之中，而且迄今為止還沒(méi)有有效疫苗。2016年，世界衛(wèi)生組織報(bào)告了2.16億例[1]，其中50萬(wàn)人死亡，由瘧疾造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過(guò)了數(shù)十億美元。

圖1. 瘧原蟲(chóng)對(duì)紅細(xì)胞的侵襲示意圖

在細(xì)胞水平，惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)紅細(xì)胞的感染引發(fā)了該疾病的臨床癥狀。該階段涉及高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)間的相互作用，由于它們的復(fù)雜性，目前仍然知之甚少。澳大利亞墨爾本大學(xué)Cowman等利用SP8 STED納米顯微鏡和特定蛋白的條件表達(dá)，確定了在入侵階段的關(guān)鍵蛋白復(fù)合物。形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)能夠使宿主-病原體相連接，并且復(fù)合物的存在是宿主-病原體緊密連接和紅細(xì)胞Ca2+釋放所必需的（圖1）。這一突破發(fā)表在Cell Host＆Microbe雜志上[2]。

瘧疾感染的主要參與者

圖2：瘧原蟲(chóng)生命周期的三個(gè)主要階段：肝臟階段，血液階段和載體階段。綠色圓圈顯示寄生蟲(chóng)從載體到宿主、從宿主到載體的關(guān)鍵入口點(diǎn)。圖片來(lái)源[3]。

進(jìn)入人類(lèi)宿主后，隨著瘧疾的發(fā)展，瘧原寄生蟲(chóng)在其生命周期中以不同的形式存在（圖2）。在所謂的血液階段[4]，以裂殖子形式存在于紅細(xì)胞，通過(guò)不同階段進(jìn)化，感染的宿主細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生約30個(gè)子代裂殖子，并準(zhǔn)備入侵其他細(xì)胞。裂殖子入侵是寄生蟲(chóng)在血流中傳播和疾病發(fā)作的關(guān)鍵。盡管如此，該疾病的分子機(jī)制尚不清楚。

為了侵入紅細(xì)胞，裂殖子必須首先與宿主細(xì)胞接觸，即所謂的“入侵前”階段[5]，使紅細(xì)胞膜變形，裂殖子配體與膜中的特定受體結(jié)合，形成緊密連接，并觸發(fā)Ca2+流。Ca2+的流動(dòng)似乎對(duì)細(xì)胞侵襲很重要。寄生蟲(chóng)與細(xì)胞的附著變得不可逆轉(zhuǎn)，并在不到2分鐘內(nèi)進(jìn)入紅細(xì)胞。

惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞結(jié)合蛋白同源物（PfRh）和紅細(xì)胞結(jié)合類(lèi)蛋白是參與入侵的重要信號(hào)[6]。PfRh家族的關(guān)鍵成員是PfRh5，其與宿主蛋白受體basigin結(jié)合可以誘導(dǎo)Ca2+釋放到紅細(xì)胞中，并標(biāo)志著裂殖子和血細(xì)胞膜的橋連通道的形成。PfRh5對(duì)于裂殖子侵入至關(guān)重要，正如抗體或可溶性basigin抑制紅細(xì)胞感染的研究所示[7]。PfRh5與PfRh5相互作用蛋白（PfRipr）和富含半胱氨酸的保護(hù)性抗原（CyRPA）一起發(fā)揮作用，但這種相互作用的功能尚不清楚。了解PfRh5/PfRipr/CyRPA的作用非常重要，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)是開(kāi)發(fā)抑制血液中瘧疾發(fā)展的疫苗的重要候選者[8]。

用正確的工具尋找瘧疾感染的答案

視頻1 PfRipr缺失的裂殖子試圖感染紅細(xì)胞

Cowman等開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因惡性瘧原蟲(chóng)系的研究工作，分別敲除PfRipr和CyRPA的基因，RiprloxCre和CyRPAloxCre[2]。在含有RiprloxCre和CyRPAloxCre基因的寄生蟲(chóng)加入重組酶（雷帕霉素誘導(dǎo)的DiCre）以快速且非常有效地調(diào)節(jié)基因缺失，從而相應(yīng)地控制兩種蛋白質(zhì)水平。作者還進(jìn)行了活細(xì)胞成像，并確認(rèn)PfRipr和CyRPA在與宿主細(xì)胞初次接觸后對(duì)紅細(xì)胞侵襲至關(guān)重要。在沒(méi)有PfRipr或CyRPA的情況下，宿主細(xì)胞膜仍然變形，但缺乏Ca2+流動(dòng)，因此寄生蟲(chóng)不能進(jìn)入血細(xì)胞（視頻1）。

SP8 STED納米顯微鏡發(fā)現(xiàn)未知

接下來(lái)，Cowman等研究了入侵期間的PfRh5、PfRipr和CyRPA的定位[2]。共聚焦成像顯示三種蛋白質(zhì)在寄生蟲(chóng)頂端優(yōu)先定位，該區(qū)域優(yōu)先與宿主細(xì)胞接觸。然而，對(duì)于生物分子的空間分布的評(píng)估只可能發(fā)生于低于顯微成像3/4衍射極限的分辨率水平上，2D通常低于30nm、3D STED（受激發(fā)射損耗）通常低于100nm。為此，將紅細(xì)胞與裂殖子一起孵育以誘導(dǎo)入侵并用抗體探針對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記。樣品被放置于Leica TCS SP8 STED納米顯微鏡上進(jìn)行2D和3D超高分辨成像（775nm，視頻2）。為了進(jìn)一步確定入侵的初始階段，研究人員還對(duì)RON4進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記，RON4是定位于寄生蟲(chóng)頂端的蛋白質(zhì)（圖3）。

圖3：侵入紅細(xì)胞的裂殖子的STED納米檢測(cè)。3D STED圖像顯示RON4（品紅色）與蛋白質(zhì)PfRh5（上圖左，綠色）、PfRipr（中，綠色）、PfCyRPA（右，綠色）的疊加。DAPI核染色顯示為藍(lán)色，紅細(xì)胞膜顯示為灰色。比例尺為1μm。圖片由Walter和Eliza Hall醫(yī)學(xué)研究Alan Cowman教授。

視頻2 裂殖子入侵紅細(xì)胞早期的STED 3D構(gòu)建

用SP8 STED獲得的空間信息顯示PfRh5、PfRipr和CyRPA在寄生蟲(chóng)頂端進(jìn)行共定位，其中也發(fā)現(xiàn)了RON4的存在（視頻2）。單個(gè)蛋白質(zhì)和PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr二聚體復(fù)合物在裂殖子膜上表現(xiàn)出拼接分布，與頂端末端的釋放一致。使用2D STED進(jìn)行更近、更高分辨率的成像證實(shí)PfRipr和CyRPA在裂殖子上擴(kuò)散，但特別局限于頂端。對(duì)PfRh5/PfRipr和CyRPA/PfRipr的共定位程度的評(píng)估顯示，PfRh5/PfRipr的比例更大。該發(fā)現(xiàn)表明CyRPA/PfRipr擴(kuò)散到裂殖子表面上，隨后PfRh5/CyRPA/PfRipR復(fù)合物直接在表面頂端聚集以結(jié)合basigin，然后觸發(fā)緊密連接的形成，并進(jìn)入入侵感染的下一步。單個(gè)PfRh5、PfRipr和CyRPA的出現(xiàn)也表明，每種蛋白質(zhì)仍可用于合成復(fù)合物。

圖3：PfRipr在侵入紅細(xì)胞的裂殖子上的定位。用WGA（綠色）染色的紅細(xì)胞膜。左為共聚焦圖像，使用2D STED（MIP）可視化PfRipr。DAPI（藍(lán)色）。白條表示1μm。

展望

對(duì)紅細(xì)胞的侵入是人類(lèi)宿主中瘧疾感染的關(guān)鍵階段。直到近，對(duì)所涉及的蛋白質(zhì)的相互作用和功能的研究是有限的，因?yàn)殛P(guān)鍵配體PfRh5的抑制*抑制感染的的入侵。使用PfRipr和CyRPA的條件表達(dá)和STED納米顯微成像，Cowman等揭示了PfRipr、CyRPA和PfRh5/PfRipr/CyRPA復(fù)合物在裂殖子入侵中的重要作用[2]。通過(guò)復(fù)合物與宿主受體basigin的結(jié)合，蛋白質(zhì)參與Ca2+釋放到紅細(xì)胞中。SP8 STED納米顯微鏡提供了必要的分辨率，以顯示PfRh5/PfRipr/CyRPA復(fù)合物在寄生蟲(chóng)和宿主細(xì)胞之間界面處的形成。以前的研究表明，CyRPA將復(fù)合物與寄生蟲(chóng)膜相連[8]，但Cowman組進(jìn)行了額外的生化分析，結(jié)果顯示情況并非如此。相反，結(jié)果表明其他蛋白質(zhì)必須將復(fù)合物錨定到宿主細(xì)胞并指導(dǎo)它在頂端的形成。

未來(lái)的工作將有助于找到參與裂殖子/宿主細(xì)胞相互作用的新蛋白質(zhì)，并了解Ca2+釋放在感染途徑中的功能作用。終，解剖宿主和病原體之間的相互作用將有助于找到更有效的方法來(lái)對(duì)抗瘧疾。

參考文獻(xiàn)

1. World Health Organization (WHO), World Malaria Report 2017 (WHO, Geneva, Switzerland, 29 November 2017)

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3. Delves M, Plouffe D, et al. (2012) The Activities of Current Antimalarial Drugs on the Life Cycle Stages of Plasmodium: A Comparative Study with Human and Rodent Parasites. PLoS Med 9(2): e1001169. DOI:10.1371/journal.pmed.1001169

4. Cowman, A.F., Crabb, B.S. (2006) Invasion of red blood cells by malaria parasites, Cell 124, 755–766, DOI: 10.1016/j.cell.2006.02.006

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DOI: 10.1073/pnas.1415466112