課堂 | 連續(xù)斷層 3D 重構(gòu)中的超薄切片制備，ARTOS 3D

當(dāng)需要以納米級(jí)分辨率觀察樣品超微結(jié)構(gòu)時(shí)，科學(xué)家通常借助電子顯微鏡（觀察表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡 SEM 和觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)的透射電鏡 TEM）——它們是當(dāng)前科研界可使用的大顯微成像工具。

電鏡成像要求對(duì)樣品進(jìn)行通常 20-150 nm的超薄切片，使用超薄切片機(jī)切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且無人為干擾因素，因此可以滿足電鏡成像對(duì)制備樣品的嚴(yán)苛要求。如果大量超薄切片具有樣品結(jié)構(gòu)的前后連續(xù)性，SEM 成像采集的圖像就可以進(jìn)行樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的 3D 重建，形成可用于分析的完整超微、精細(xì)立體圖像，即連續(xù)斷層成像技術(shù)（Array Tomography, AT）。

今天，小編簡(jiǎn)要介紹一下 AT 成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：連續(xù)超薄切片樣品制備。

111超薄切片之重要性111

AT 常用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)等生物 / 生物大分子結(jié)構(gòu)的納米分辨率、3D 結(jié)構(gòu)觀察和分析，主要步驟為包埋樣品連續(xù)（超?。┣衅?、TEM / SEM 或光學(xué)顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像、對(duì)獲得的一系列圖像進(jìn)行重建分析。AT 可以獲得的有效信息包括超微結(jié)構(gòu)的定量、體積分析和細(xì)胞 / 蛋白的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)等，相較于共聚焦顯微鏡獲得的圖像，具有更高的水平和空間分辨率（可達(dá) 0.2 nm）。

超薄切片主要用于 TEM 成像前的樣品制備，以納米分辨率觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。無污染且獲取快速的超薄切片的主要優(yōu)勢(shì)在于：

• 整個(gè)切片均可用于電鏡成像，適合大尺寸樣品分析；

• 單張切片電子透射均一性好，保證結(jié)果可靠性；

• 制備速度快，短時(shí)間即可獲得大量切片；

• 適用樣品范圍廣，生物樣本和工業(yè)材料均適用。

11超薄切片的基本原理11

對(duì)于 TEM 或者 3D 結(jié)構(gòu)重建，樣品高質(zhì)量連續(xù)切片是前提。因此，一臺(tái)如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D（20-50 nm）（見圖 1）一樣穩(wěn)定可靠的超薄切片機(jī)是開展實(shí)驗(yàn)的*工具。

▲圖 1. Leica 連續(xù)超薄切片機(jī)新品 —— EM ARTOS 3D

樣品被安裝在可上下前后移動(dòng)的電動(dòng)機(jī)械臂上，機(jī)械臂垂直上下移動(dòng)、遇到固定的玻璃刀或鉆石刀時(shí)，這條樣品帶被切下（圖 2），然后刀臺(tái)自動(dòng)向左移動(dòng)，按照設(shè)定的切片厚度完成第二條切割。同理，隨后刀臺(tái)再向左移動(dòng)，完成第三條切割（圖 3）。從刀片上直接取下切片是十分困難的，因?yàn)樗浅１∏掖嗳?，徠卡超薄切片機(jī)采用溫和水流托舉的方式使條帶不斷分離，能夠保證條帶質(zhì)量不被破壞同時(shí)操作極其簡(jiǎn)單（冷凍切片情況可借助顯微操作），然后進(jìn)行上電鏡前的其它必要處理。

▲ 圖 2. EM ARTOS 3D 超薄切片機(jī)樣品切割位置基本結(jié)構(gòu)

▲ 圖 3. EM ARTOS 3D 制備的連續(xù)超薄切片條帶

連續(xù)斷層成像的樣品制備

多數(shù)未處理的生物樣品比較柔軟，AT 成像前的樣品制備主要包括下面幾個(gè)步驟：

• 組織固定

• 樣品水分抽提和包埋

• 連續(xù)切片和切片條帶收集

• 切片染色以用于成像（如果需要）

后使用 SEM 或光學(xué)顯微鏡（通常熒光成像情況）對(duì)結(jié)構(gòu)上具有連續(xù)性的切片進(jìn)行成像，合成圖像以進(jìn)行 3D 重建和分析。

對(duì)于市面上多數(shù)超薄切片機(jī)，使用者在 AT 成像的樣品制備時(shí)，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)這是一項(xiàng)耗時(shí)耗力、中間一些操作必須手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 連續(xù)超薄切片機(jī)，能夠自動(dòng)化連續(xù)切片、顯著縮短樣品制備時(shí)間、減少人工操作、切片無褶皺、厚度均一、溫和水流取條帶、提高樣品制備成功率等眾多優(yōu)點(diǎn)，在向下兼容普通超薄切片需要的同時(shí)，特別合適高通量切片和 AT 等前沿研究對(duì)樣品制備的嚴(yán)苛要求 

1111111數(shù)據(jù)展示1111111

▲ 圖 4. AT 技術(shù)獲得的鼠淋巴結(jié) 3D 結(jié)構(gòu)重建